E.coli 10*3 колоний в 1 мл

3. Индукция мутаций под действием ультрафиолетового (УФ) облучения (демонстрация). Объект облучают при красном свете бактерицидной лампой ВУФ-15 на расстоянии 60 см от его центра.

Предварительно определяют бактерицидную дозу УФ-облучения, устанавливая оптимальную мутагенную дозу (0,1—1 % от числа выживших бактерий).

Для получения lac-мутантов Е.coli испытуемую культуру, содержащую 2х 10 8 бактерий в 1 мл среды, выращивают в питательном бульоне в течение 14—18 ч. Бактерии осаждают центрифугированием, ресуспендируют в 40 мл 0,1 моль 1 л раствора MgSО₄ и охлаждают во льду (для прекращения деления клеток). Затем суспензию в объеме 50 мл помещают в стерильную чашку Петри и облучают в течение 15—150 сек., после чего клетки осаждают центрифугированием, ресуспендируют в таком же объеме питательного бульона и инкубируют при 37 0 С в течение 14—18 часов. Затем из разведения 10 2 —10 5 по 0,1 мл высевают на плотную селективную питательную среду (среда Эндо) в чашки Петри и растирают шпателем.

Для выделения антибиотикорезистентных мутантов используют штамм E.coli В или К12, который высевают после облучения на минимальный агар с определенной концентрацией антибиотика. Например, ампициллин—10 мкг/мл, левомицетин— 5 мкг/мл, пенициллин — 100 мкг/мл.

На среде Эндо lac-мутанты Е. coli образуют бесцветные ко­лонии. Клетки Е. coli, выросшие на среде с указанной концент­рацией антибиотика, являются к нему резистентными. Параллельно делают контрольные посевы.

4. Опыт трансформации (демонстрация). Реципиентом является стрептомициночувствительный штамм кишечной палочки — Escherichia coli Str s , донором — ДНК, выделенная из штамма Escherichia coli Str r , устойчивого к стрептомицину. Селективной средой для отбора рекомбинантов служит питательный агар со стрептомицином (100 ЕД/мл).

К 1 мл бульонной культуры E.coli добавляют 1 мкг/мл ДНК донора, смесь инкубируют при 37 0 С в течение 30 мин, после чего в пробирку вносят смесь 0,1 мг/мл раствора ДНКазы (для разрушения ДНК, не проникшей в бактериальные клетки реципиентного штамма), и вновь инкубируют в течение 5 мин. Для определения количества образовавшихся стрептомицинустойчивых рекомбинантов 0,1 мл неразведенной смеси высевают на селективную среду в чашку Петри. Для определения количества клеток реципиентной культуры готовят ее десятикратные разведения в изотоническом растворе хлорида натрия до 10 –5 – 10 -6 (для получения сосчитываемого количества колоний), высевают по 0,1 мл на питательный агар без стрептомицина, а для контроля — на агар со стрептомицином. Посев инкубируют при 37 0 С. На следующий день учитывают результаты опыта и определяют частоту трансформации по отношению количества выросших рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного штамма. На среде со стрептомицином реципиентная культура не должна расти, т.к. она чувствительна к стрептомицину. Частота трансформации определяется отношением количества выросших рекомбинантных клеток к числу клеток реципиентного штамма .

Опыт специфической трансдукции (демонстрация).Реципиентом является штамм Е. coli lac — , лишенный β-галактозидазного оперона, контролирующего ферментацию лактозы. Трансдуцирующий фаг—фаг λ dgal, часть генов которого замещена дефектным β -галактозидазным опероном Е. сoli, неспособным вызывать лизис кишечной палочки. На селективной среде Эндо лактозоотрицательные колонии бактерий реципиентного штамма образуют бесцветные колонии, а лактозоположительные колонии рекомбинантного — красные колонии с металлическим блеском.

К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиентного штамма добавляют 1 мл трансдуцирующего фага λ dgal (концентрация 10 6 —10 7 бактерий в 1 мл). Смесь инкубируют при 37 0 С в течение 60 мин, затем готовят ряд десятикратных разведении. Из пробирки с разведением 10 6 делают высев по 0,1 мл культуры на три чашки Петри со средой Эндо и равномерно распределяют жидкость шпателем по поверхности среды. Посевы инкубируют в течение суток, после чего отмечают результаты опыта и вычисляют величину трансдукции по отношению количества клеток рекомбинантов (трансдуктантов), обнаруженных на всех чашках, к числу клеток реципиентного штамма.Частота трансдукции определяется отношением числа клеток рекомбинантов к числу клеток реципиентного штамма.

6. Опыт конъюгации с целью передачи фрагмента хромосомы, содержащего ген leu, контролирующего синтез лейцина (демонстрация). Донор — штамм Е. coli K12 Hfr leu + Str s . Реципиент—штамм E. coli K12F — leu — Str r . Селективная среда для выделения рекомбинантов — минимальная глюкозосолевая среда со стрептомицином. К 2 мл 3-часовой культуры реципиента добавляют 1 мл бульонной культуры донора. Посевы инкубируют при 37 0 С в течение 30 мин, затем смесь разводят до 10 –2 — 10 -3 и высевают по 0,1 мл на селективную агаровую среду в чашки Петри, на которой вырастут только колонии рекомбинантов. В качестве контроля на ту же среду высевают штаммы донора и реципиента, которые не будут расти на ней, так как первый штамм чувствителен к стрептомицину, а второй ауксотрофен по лейцину. Культуру донорского штамма высевают также на селектив­ную среду без стрептомицина, а культуру реципиентного штамма—на полную среду (питательный агар с антибиотиками) для определения числа жизнеспособных клеток. Посевы инкубируют до следующего дня при 37 0 С. После подсчета числа выросших колоний определяют частоту рекомбинаций по отношению количества рекомбинантных клеток к реципиентным.

7. Учет ПЦР при уреаплазмозе (демонстрация, рис. 31).

К 1 мл 3-часовой бульонной культуры реципиентного штамма добавляют 1 мл трансдуцирующего фага λ dgal (концентрация 10 6 —10 7 бактерий в 1 мл). Смесь инкубируют при 37 0 С в течение 60 мин, затем готовят ряд десятикратных разведении. Из пробирки с разведением 10 6 делают высев по 0,1 мл культуры на три чашки Петри со средой Эндо и равномерно распределяют жидкость шпателем по поверхности среды. Посевы инкубируют в течение суток, после чего отмечают результаты опыта и вычисляют величину трансдукции по отношению количества клеток рекомбинантов (трансдуктантов), обнаруженных на всех чашках, к числу клеток реципиентного штамма.Частота трансдукции определяется отношением числа клеток рекомбинантов к числу клеток реципиентного штамма.

Кишечная палочка в моче

Многие годы пытаетесь вылечить ПОЧКИ?

Глава Института нефрологии: «Вы будете поражены, насколько просто можно вылечить почки просто принимая каждый день.

Множество микроорганизмов, живущих в окружающей среде, заселяет и организм человека. Одни из них являются безвредными и даже полезными, а другие в определенных количествах приводят к появлению заболеваний. Есть и такие, которые, являясь изначально полезными «обитателями» желудочно-кишечного тракта, при изменении условий в нем становятся патогенными, то есть способными вызвать развитие патологического процесса. Поэтому такие микроорганизмы именуются условно-патогенными. К их числу относятся практически все представители семейства Энтеробактерий, в которое входят кишечные палочки (Эшерихия коли), протеи, цитробактеры, клебсиеллы. Из семейства стафилококков условно-патогенными являются только негемолитические виды, а Staphylococcus haemolyticus, способных растворять эритроциты, в организме быть не должно.

Роль кишечной палочки в организме

Подавляющая часть всех штаммов кишечной палочки не приносит организму человека вреда. Они сосуществуют вместе, на пользу себе и друг другу. Так, бактерии, постоянно живущие, к примеру, в кишечнике, получают от человека комфортную температуру и влажность, защиту от ультрафиолетовых лучей и прямого кислорода. Со своей стороны, они обеспечивают человеческий организм некоторыми витаминами (К, группы В) и жирными кислотами, участвуя в их синтезе, расщепляют альбумины, метаболизируют билирубин, холестерин и желчные кислоты, а также борются с патогенными бактериями и выживают их со своей территории.

К таким неблагоприятным факторам, значительно снижающим уровень иммунитета и ведущим к бактериальному дисбалансу, можно отнести:

• частые вирусные заболевания;
• несостоятельность лимфатической системы у маленьких детей;
• нервные и физические перегрузки;
• наличие возрастных изменений в работе внутренних органов;
• длительное употребление алкоголя, табака, наркотиков.

В результате в кишечнике может начаться дисбиоз и дисбактериоз, и патогенная кишечная палочка начнет искать для себя новые биологические среды для обитания. Одними из таких «обиталищ» становятся мочевыделительные органы, и подтверждением этому является появление такого показателя, как кишечная палочка в моче.

Каким образом происходит обнаружение микроорганизмов

Если органы мочевыделительной системы здоровы и не поражены патологическим процессом, то моча не должна содержать никаких микроорганизмов. То есть, в норме урина человека является стерильной. Обнаружение кишечной палочки в моче может произойти случайно, при диспансерном или плановом обследовании человека. Как правило, это возможно в тех довольно редких случаях, когда клиническая симптоматика патологии минимальна, и человек не обращается за врачебной помощью.

Но в большинстве случаев выявление патогенной микрофлоры происходит, когда пациент предъявляет определенные жалобы на состояние мочевыделительных органов и направляется врачом на лабораторное обследование. Кишечная палочка в моче у ребенка или взрослого обнаруживается как при общем исследовании, так и при бакпосеве, то есть в результате микробиологического исследования урины.

При общем анализе мочи, наряду с определением многих других показателей, лаборант, посредством микроскопического способа (через микроскоп), может обнаружить в образце и различные микроорганизмы. Их количество указывается с помощью знака «плюс», одним, двумя или тремя. Также он может визуально определить и вид микрофлоры. Но более детально и точно констатация вида и рода возбудителя, в частности, кишечной палочки в моче, происходит при микробиологическом способе исследования.

В ходе этого исследования образец мочи помещается в чашки Петри на питательные среды и выдерживается в комфортных для микроорганизмов условиях несколько дней. Уже на вторые сутки в посевах мочи начинается формирование колоний, у которых форма, размер и другие характеристики строго соответствуют виду бактерий. Так, на среде из мясопептонного агара кишечная палочка формирует колонии серо-голубого оттенка, почти прозрачные, на среде Эндо колонии выглядят как плоские образования красного цвета.

При микробиологическом способе можно не только уточнить принадлежность микроорганизмов, обнаруженных в моче, но и осуществить исследование их чувствительности к антибактериальным препаратам. Для этого в разные части колоний помещаются ватные диски, пропитанные определенным антибиотиком. Через некоторое время, оценив степень разрушения колонии или замедление ее роста, можно установить, какой препарат будет максимально эффективен в терапии.

Чтобы результаты общего анализа мочи или ее микробиологического исследования оказались достоверными, очень важно соблюдать правила сбора урины. Они следующие:

• перед забором урины необходимо тщательно промыть промежность, особенно у женщин;
• применять только чистую высушенную посуду, а лучше специальные стерильные емкости для взрослых и детей, продающиеся в аптеках;
• перед сбором мочи тщательно вымыть руки с мылом;
• берется только средняя порция урины, начальная и конечная порции исключаются;
• сразу после сбора мочи емкость закрывается крышкой и доставляется в лабораторию, но можно несколько часов хранить урину и в холодильнике.

Получение лечащим врачом данных о наличии Эшерихии коли в моче может очень помочь в диагностике патологии, определении ее формы и дальнейшего прогноза. Кроме того, результаты теста на чувствительность к антибиотикам необходимы, чтобы определиться, как лечить патологию грамотно и эффективно.

О чем свидетельствует наличие бактерии Еscherichia coli в моче

Обнаружение бактерий в урине происходит при дополнительном лабораторном обследовании и является ценным диагностическим признаком. Оно помогает врачу подтвердить инфекционную природу заболевания, которое он подозревает у пациента, и назначить адекватную терапию, учитывающую вид возбудителя.

Выделение микроорганизмов с мочой может происходить, если они оказались в любом отделе мочевыделительной системы. Проникновение патогенных штаммов происходит несколькими путями:

• при несоблюдении гигиенических правил, в результате чего микроорганизмы из области заднего прохода могут переместиться во влагалище и мочеиспускательный канал;
• распространение инфекции с воспаленной слизистой оболочки вульвы или влагалища;
• восходящим путем в верхние отделы мочевых каналов;
• гематогенным путем, то есть по кровеносной системе;
• лимфогенным путем, по лимфатическим сосудам.

Значимость этих способов появления бактерий в мочевыделительной системе различна и зависит от пола, возраста, фонового состояния организма пациента. Так, кишечная палочка в мочевом пузыре чаще всего оказывается именно восходящим путем, заболевания почек развиваются также при сочетании восходящего и гематогенного путей, а уретрит в большинстве случаев может быть связан с половыми инфекциями.

Кроме того, существуют и неблагоприятные факторы, которые способствуют задержке мочи в почках или мочевом пузыре. Это всевозможные стриктуры, стенозы, извитость мочеточника, а также состояние беременности, при которой увеличенная матка давит на мочевой пузырь. В результате нервно-рефлекторная возбудимость пузыря повышается, что ослабляет местный иммунитет и позволяет бактериям прочно обосноваться в слизистой оболочке.

Обычно при острой форме воспаления кишечная палочка массированно поражает орган, в больших количествах попадает в мочевые каналы и выделяется с мочой. При хроническом течении заболевания степень бактериурии снижается. На это также влияет и оказываемое антибактериальное лечение.

Точно определить нозологию врач может на основании анализа клинических симптомов патологии, выявление Эшерихии коли лишь подтверждает инфекционную природу патологического процесса в органе. Так, пиелонефрит характеризуется сильным болевым синдромом в пояснице, дизурическими нарушениями, изменением состава мочи. Цистит или уретрит также проявляются определенными комплексами клинических симптомов.

Следует отметить, что причиной возникновения синдрома интоксикации при инфекционных заболеваниях мочевыводящих путей является негативное воздействие на организм именно патогенных микроорганизмов, в частности, Эшерихии коли. Повышение температуры тела, головная боль, отсутствие аппетита, вялость и апатия – это следствия влияния бактериальных токсинов и пирогенных веществ, продуцируемых микрофлорой, на головной мозг человека.

Как избавиться от бактерий в моче

Ликвидировать патологические симптомы, кишечную палочку в моче и улучшить состояние пациента можно, точно диагностировав заболевание. В зависимости от того, какой отдел мочевыделительной системы поражен, и какую форму и течение имеет воспалительный процесс, происходит назначение соответствующих лекарственных средств.

Лечение обнаруженной кишечной палочки в моче означает воздействие на весь воспалительный процесс, ускорение восстановления поврежденной слизистой оболочки, укрепление защитных сил организма, купирование болевого и интоксикационного синдромов. Поэтому для медикаментозного лечения используются средства следующих групп:

• антибактериальные препараты;
• уросептические препараты;
• обезболивающие и жаропонижающие средства;
• общеукрепляющая терапия (витамины, иммуномодуляторы).

Лечение антибиотиками кишечной палочки в моче по праву находится на первом месте в схеме терапии. Именно этиотропное лечение, то есть направленное на возбудителя воспаления, способно купировать и все остальные проявления болезни. Остальные медикаментозные средства дополняют и закрепляют этот эффект. Поэтому после диагностики патологии очень важно выбрать правильный антибиотик.

Предпочтение отдается препаратам широкого спектра действия, например, производным пенициллина (Амоксиклав, Ампициллин), фторхинолонам (Нолицин), используются и традиционные нитрофурановые средства (Фурагин, Фурадонин). Но самым лучшим урологическим антибиотиком на сегодняшний день является Монурал, или фосфомицин. Однократное использование дозы в 2 или 3 грамма, что зависит от возраста больного, способно окончательно очистить мочевые каналы от возбудителей, попутно избавив пациента и от других симптомов болезни.

Выявление Эшерихии коли в моче в любых количествах является неблагоприятным признаком. Оно говорит о наличии инфекционного заболевания мочевыводящих путей и требует незамедлительного лечения.

Для лечения почек наши читатели успешно используют Ренон Дуо. Видя, такую популярность этого средства мы решили предложить его и вашему вниманию.
Подробнее здесь…

Кроме того, существуют и неблагоприятные факторы, которые способствуют задержке мочи в почках или мочевом пузыре. Это всевозможные стриктуры, стенозы, извитость мочеточника, а также состояние беременности, при которой увеличенная матка давит на мочевой пузырь. В результате нервно-рефлекторная возбудимость пузыря повышается, что ослабляет местный иммунитет и позволяет бактериям прочно обосноваться в слизистой оболочке.

6.2.1. Испытание на отсутствие бактерий E. coli (качественный метод)

10 г исследуемого образца, растворенного или разбавленного стерильным фосфатно-буферным раствором 1:10, переносят в количестве 10 мл (соответствует 1 г или 1 мл испытуемого ЛС) в 100 мл соево-казеинового бульона (или среды № 8). Перемешивают и инкубируют в течение 18 – 24 ч. При наличии роста 1 мл содержимого флакона переносят в 100 мл бульона Мак-Конки (или среды № 3) и инкубируют 24 – 48 ч при температуре (43 ± 1) о С.

При обнаружении роста в бульоне бактериологической петлей делают пересев на агар Мак-Конки или среду № 4. Посевы инкубируют в течение 18 – 48 ч (агар Мак-Конки) или 18 – 24 ч (среда № 4). Если после инкубации на плотных питательных средах выявлены колонии, типичные для E. coli (табл. 7), их микроскопируют. При обнаружении в мазках мелких грамотрицательных палочек отдельные типичные колонии пересевают в пробирки на скошенный соево-казеиновый агар или среду № 1 и инкубируют в течение 18 – 24 ч для накопления чистой культуры микроорганизма.

Для идентификации выделенных бактерий используют биохимические тесты на цитохромоксидазу (п.8.1), индол (п.8.2) и способность утилизировать натрия цитрат. Для этого из пробирок с чистой культурой делают пересевы на агар Симмонса (или среду № 14) и соево-казеиновый бульон (или среду № 15). Через 18 – 24 ч инкубации отмечают рост бактерий или его отсутствие на агаре Симмонса (или среде № 14). Утилизацию цитрата устанавливают по смещению рН среды в щелочную сторону (изменению цвета среды с зеленого на синий). Наличие индола определяют по появлению красного кольца на поверхности соево-казеинового бульона (или среды № 15) при добавлении реактива Ковача.

Если в ходе исследования обнаруживают типичные грамотрицательные палочки, не содержащие фермент цитохромоксидазу, не утилизирующие натрия цитрат и образующие индол, считают, что ЛС контаминировано бактериями E. coli.

6.2.2. Количественное определение бактерий E. coli

Количественное определение E.coli проводят так же, как и количественное определение энтеробактерий, устойчивых к желчи (п. 6.1.2), делая пересев из гомогената А в пробирки с бульоном Мак-Конки (или средой № 3). При обнаружении роста в пробирках (табл. 7) из каждой пробирки делают пересев бактериологической петлей на агар Мак-Конки или среду № 4. Посевы инкубируют в стандартных условиях в течение 18 – 48 ч (агар Мак-Конки) или 18 – 24 ч (среда № 4).

При обнаружении на указанных средах типичных колоний бактерий (табл. 7), по морфологическим и тинкториальным свойствам представляющих собой грамотрицательные палочки, которые не содержат фермент цитохромоксидазу, не утилизируют натрия цитрат и образуют индол, делают вывод, что ЛС контаминировано бактериями E. coli. Наиболее вероятное количество клеток E. coli в 1 г или в 1 мл испытуемого образца определяют по табл. 6.

При обнаружении роста в бульоне бактериологической петлей делают пересев на агар Мак-Конки или среду № 4. Посевы инкубируют в течение 18 – 48 ч (агар Мак-Конки) или 18 – 24 ч (среда № 4). Если после инкубации на плотных питательных средах выявлены колонии, типичные для E. coli (табл. 7), их микроскопируют. При обнаружении в мазках мелких грамотрицательных палочек отдельные типичные колонии пересевают в пробирки на скошенный соево-казеиновый агар или среду № 1 и инкубируют в течение 18 – 24 ч для накопления чистой культуры микроорганизма.

Определение общего количества бактерий в молоке

Вначале готовят разведения (10 -1 — 10 -9 ), для чего из отобран­ной пробы молока стерильной пипеткой берут 1 мл и перено­сят в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды (техни­ку приготовления разведений см. в 5.1.1). Затем при глубинном посеве из разведений молока, обесцвечивающегося с резазури­ном менее чем через 20 мин, т. е. разведений 10 -4 ; 10 -5 и 10 -6 , берут отдельной стерильной пипеткой по 1 мл суспензии и вносят в стерильные чашки Петри в двух- и трехкратной повторности.

При обесцвечивании молока с резазурином более чем че­рез 20 мин посев делают из разведений 10 -3 , 10 -4 , 10 -5 . В чаш­ки с суспензией вносят расплавленный и охлажденный до 45— 50°С МПА. Суспензию с агаром перемешивают и чашки Пет­ри с посевом помещают в термостат при 28—30°С. После 2-дневной инкубации подсчитывают колонии бактерий в чаш­ках. Количество дрожжей и плесневых грибов подсчитывают на 4-й день. Число колоний умножают на степень разведения и определяют среднее арифметическое их число после учета колоний в трех чашках. Это соответствует числу клеток в 1 мл молока.

При оценке качества молока определение титра коли имеет важное значение, так как кишечная палочка — обитатель ки­шечника человека и животных и ее присутствие в молоке ука­зывает на фекальное загрязнение молока.

Коли-mump — это наименьший объем (в мл) или масса (в г) исследуемого материала, в котором обнаруживается хотя бы одна клетка кишечной палочки.

Для выявления кишечной палочки и определения ее тит­ра в молоке используют газообразующую способность группы бактерий Е. coli-aerogenes на жидкой среде Булира следующего состава: МПБ — 1 л, маннит — 10 г, NaCl — 5 г.

Насыщенным раствором соды устанавливают нейтраль­ную реакцию среды, затем подкрашивают ее насыщенным вод­ным раствором нейтральрота до вишнево-красного цвета фильтруют, разливают в пробирки с поплавками и стерилизуют в автоклаве при 1 атм.

В пробирки со средой Булира вносят по 1 мл суспензии из соответствующего разведения. Посев проводят из всех разведений в двух- и трехкратной повторности. Пробирки с посе­вом выдерживают 48 ч при 42°С.

В связи с тем что в пробах молока могут быть другие бактерии, сбраживающие лактозу с образованием газа, точно установить наличие кишечной палочки можно, сделав посев из сбродившей жидкости на специфическую среду Эндо. Если бродильная проба положительная и культура на среде Эндо да­ст ярко-красные колонии, то в исследуемом субстрате присут­ствует кишечная палочка. Для полной идентификации нужны дополнительные данные: об отсутствии разложения желатины, об отсутствии газа и кислоты при выращивании на сахарозе и об образовании скатола и индола и МПБ.

Коли — титр молока можно определить на среде Кесслера, в состав которой входят желчь, краситель генциановый фиолетовый — вещества, подавляющие рост молочнокислых и других грамположительных бактерии.

Молоко или молочные продукты вначале разводят в со­отношении 1 : 10, 1 : 100 и т. д. Затем берут 6 пробирок со сре­дой Кесслера (среда 9, см. 14.2.3): и три из них вносят по 1 мл, в остальные — по 0,1 мл каждою разведения. Засеянные про­бирки ставят на 2 сут в термостат при температуре 43°С. От­сутствие газообразования во всех 6 пробирках указывает на чис­тоту продукта, и при этом принято считать, что его коли — титр выше 3 м л; при газообразовании в одной пробирке, засеянной 1 мл исследуемого продукта, коли – титр равен 3 мл; при образовании газа более чем в одной пробирке с 0,1 мл разведения молока коли — титр считается равным 0,3 мл. Такое молоко непригодно к употреблению. При образовании газа в 6 или 5 пробирках с 0,1 мл разведения молока (очень загрязнённое молоко) — коли – титр менее 0,3 мл.

Идентификацию кишечной палочки в этом случае также проводят на среде Эндо, для чего высевают на нее суспензию из газообразующих пробирок и ставят их на 1 сут в термостат при температуре 37°С.

На основании определения титра кишечной палочки ка­чество молока подразделяют на классы (табл. 6).

Таблица 6 — Определение качества молока по коли – титру

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

Вначале готовят разведения (10 -1 — 10 -9 ), для чего из отобран­ной пробы молока стерильной пипеткой берут 1 мл и перено­сят в пробирку с 9 мл стерильной водопроводной воды (техни­ку приготовления разведений см. в 5.1.1). Затем при глубинном посеве из разведений молока, обесцвечивающегося с резазури­ном менее чем через 20 мин, т. е. разведений 10 -4 ; 10 -5 и 10 -6 , берут отдельной стерильной пипеткой по 1 мл суспензии и вносят в стерильные чашки Петри в двух- и трехкратной повторности.

Количество колиформных бактерий выражают в виде коли-титра или коли-индекса. Коли-титр воды – минимальное количество БГКП в 1 л воды. Коли-индекс воды – количество БГКП в 1 л воды.

Для определения этих показателей используют метод мембранных фильтров и титрационный (бродильный) метод.

Исследование воды методом мембранных фильтров. Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциально-диагностической среде и последующей идентификации колоний по культуральным и биохимическим признакам.

Перед использованием мембранные фильтры проверяют на отсутствие трещин, отверстий, пузырей и кипятят в дистиллированной воде в течение 10 мин (при этом нельзя допускать скручивания фильтров). Для полного удаления из фильтров остатков растворителей, которые применяются при их изготовлении, кипячение следует повторить 3-5 раз со сменой дистиллированной воды. Подготовленные таким образом фильтры сохраняются в банках с дистиллированной водой или в сухом виде. В день постановки опыта фильтры повторно стерилизуют кипячением в дистиллированной воде в течение 10 мин.

Фильтрование производят с помощью специальных приборов или фильтра Зейтца. Перед посевом воды фильтровальный аппарат стерилизуют фламбированием после обтирания ватным тампоном, смоченным спиртом. После охлаждения на нижнюю часть фильтровального аппарата (столик) кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его верхней частью прибора (стаканом, воронкой) и закрепляют устройством, предусмотренным конструкцией прибора. Отросток колбы, в которую фильтруется вода, с помощью резиновой трубки соединяют с водоструйным или масляным насосом для создания вакуума в приемном сосуде (около 0,25 атм).

Объем пробы воды зависит от целей исследования. При анализе воды, поступающей в водопроводную сеть, и в наиболее характерных ее точках необходимо анализировать объем не менее 333 см 3 , профильтровывая этот объем не менее чем через два фильтра.

На этапах очистки анализируют не менее двух десятикратных объемов воды, выбранных в зависимости от ее качества таким образом, чтобы на одном из фильтров вырастало не более 30 колоний бактерий группы кишечных палочек. При этом необходимо ориентироваться на результаты предыдущих анализов воды в этих же пунктах (например, для воды после первичного хлорирования могут быть выбраны объемы 10 и 100 см3; для воды необеззараженной — 0,1, 1 и 10 см 3 ). При анализе воды неизвестного качества следует засевать 3-4 десятикратных объема (например, из водопроводной сети можно фильтровать 3; 30; 100; 200 см 3 воды; по этапам очистки — 0,1; 1; 10; 100 см 3 воды).

Для фильтрования в воронку или стакан наливают необходимые объемы воды, начиная с меньших, а затем большие, каждый раз меняя фильтры. Самый меньший объем воды — 1 мл — следует фильтровать через фильтр, предварительно смоченный стерильной водой. После фильтрования верхнюю часть прибора снимают и фильтр осторожно (при сохранении вакуума для удаления излишка влаги на фильтре) стерильным пинцетом переносят на среду Эндо в чашку Петри. Фильтр накладывают вверх поверхностью, на которой осели бактерии, избегая появления пузырьков воздуха между фильтром и средой. На одну чашку можно разместить 4 фильтра, под каждым на дне чашки следует надписать объем воды, номер пробы и число.

Если вода мутная, то фильтрование ведется сразу через два фильтра: предварительный фильтр № 6 (для задержания крупных частиц) помещают на фильтр № 2. После фильтрования оба фильтра переносят на среду Эндо. Чашки с фильтрами помещают в термостат и инкубируют при температуре 37°С в течение 24 ч. При окончательном результате учитывают колонии, выросшие на обоих фильтрах.

При наличии в воде БГКП на фильтрах появляется рост типичных для этих бактерий колоний: темно-красные с металлическим блеском или красные, розовые с красным центром, имеющие четкий отпечаток на обратной стороне фильтра. Бактерии из таких колоний окрашивают по Граму и микроскопируют. С культурой грамотрицательных бактерий лактозополо-жительных колоний ставят оксидазный тест для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceae от Pseudomonadaceae (последние являются оксидазообразующими бактериями). Для этого фильтр с выросшими на нем колониями бактерий переносят пинцетом, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченной диметил-п-фенилендиамином. При наличии оксидазы реактив окрашивает колонию в синий цвет. 2-3 колонии, не изменившие окраску (оксидазоотрицательные) засевают в пробирку с полужидкой средой с 0,5% раствором глюкозы и инкубируют при 37°С. При появлении кислоты и газа результат считают положительным. Подсчитывают число красных колоний на фильтре и определяют коли-индекс.

Колииндекс (индекс ОКБ, БГКП) высчитывают следующим образом: количество бактерий группы кишечных палочек, выросших в анализируемом объеме воды, умножают на 1000 см 3 и делят на этот объем воды.

где К- количество проверенных на принадлежность к ОКБ (БГКП) колоний на фильтрах;

V- объем профильтрованной воды через фильтры, на которых велся учет.

Пример 1. При посеве трех объемов воды по 100 см 3 на одном фильтре выросло три колонии бактерий группы кишечных палочек, на двух других нет роста; коли-индекс равен (3*1000):300 = 10.

Пример 2. При посеве 10 и 100 см 3 воды на одном фильтре выросла одна колония, на другом выросло пять колоний; коли-индекс равен (6*1000):110 = 54.

Если на одном из фильтров сплошной рост бактерий и подсчет их невозможен, тогда в расчет принимают тот объем воды, при фильтровании которого на фильтре выросли изолированные колонии.

Для перевода индекса в титр используют формулу:

В соответствии с ГОСТ, у воды питьевой индекс ОКБ должен быть не более 3, у воды плавательного бассейна — не более 10.

Метод мембранных фильтров является современным, точным, менее трудоемким и более дешевым в сравнении с титрационным методом. Он удобен и тем, что позволяет концентрировать бактерии, содержащиеся в значительном объеме воды на небольшой поверхности фильтра. Однако одним из самых существенных недостатков метода является то, что этим методом выявляется меньшее количество бактерий в сравнении с титрационным. Для большей точности рекомендуется исследование воды проводить параллельно обоими методами.

Титрационный метод исследования воды основан на накоплении бактерий после посева установленного объема воды в жидкую питательную среду, с последующим пересевом на дифференциально-диагностическую среду и идентификации колоний по культуральным и биохимическим тестам.

Объем засеваемой воды зависит от характера исследуемого объекта, но обязательно посев ведется в 2-3, а в некоторых случаях — в 5-ти повторностях. Объемы воды выбирают с таким расчетом, чтобы в одном из разбавлений получить хотя бы один отрицательный результат. При исследовании на этапах очистки и обеззараживания засевают 100; 10; 1 и 0,1 см 3 воды; на выходе в водопроводную сеть и в наиболее характерных ее точках засевают три объема по 100 см 3 , три объема по 10 см 3 и три объема по 1 см 3 .

Посев воды производится в глюкозопептонную среду (1% пептонная вода, 0,5% раствор глюкозы, 0,5% раствор хлорида натрия, индикатор Андреде, поплавок). Для посевов больших объемов воды используют концентрированную среду, содержащую 10-кратные количества указанных веществ. Так, посев 100 мл воды производят в 10 мл концентрированной среды, 50 мл — в 15 мл концентрированной среды, 10 мл — в 1 мл концентрированной среды; 1 мл и последующие разведения — в 10 мл глюкозопептонной среды нормальной концентрации. Большие объемы воды засеваются во флаконы или колбы, меньшие — в пробирки. Посевы инкубируют в термостате в течение суток при температуре 37°С.

Из пробирок с посевами, в которых наблюдается помутнение (а также образование кислоты и газа в поплавке), делают высев петлей штрихами на поверхность среды Эндо, разделенной на 3-4 сектора. Посевы выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 16-18 ч. При наличии на среде Эндо характерных для БГКП колоний (красных с металлическим блеском) следует провести все тесты, перечисленные выше. Положительный ответ на наличие БГКП дается в том случае, если наблюдается рост характерных колоний, образованных оксидазоотрицательными, Гр(-) бактериями, сбраживающих глюкозу при 37°С с образованием кислоты и газа. Таким образом, положительный ответ выдается через 40—42 ч.

Результат выражается в виде индекса (титра) БГКП, цифровое выражение которого определяют по таблицам: при анализе питьевой воды на выходе в водопроводную сеть и из нее – по табл. 5 и 6; при анализе воды на этапах очистки и обеззараживания – по табл. 7.

Таблица 5. Определение индекса БГКП при исследовании 300 см 3 воды.

Количество положительных результатов анализа воды из:	Коли-индекс	Пределы индекса (доверительные границы)	Коли-титр
трех флаконов по 100 см 3	трех пробирок по 10 см 3	трех пробирок по 1 см 3	нижний	верхний
Менее 3	—	—	Более 333
0,5
0,5
0,5
0,9
Более1100	—	—	Менее 0,9

Таблица 6. Определение коли-индекса БГКП при исследовании 500 см 3 воды.

Количество положительных результатов анализа воды из пяти флаконов по 100 см 3	Коли-индекс	Пределы индекса (доверительные границы)	Коли-титр
нижний	верхний
Менее 2	6,0	Более 455
0,1	12,6
0,5	19,2
1,6	29,4
3,3	52,9
Более 16	8,0	—	Менее 62

Таблица 7. Определение индекса БГКП при исследовании воды по этапам очистки.

Объем исследуемой воды, см 3	Коли-индекс	Коли-титр
1,0	0,1
—	—	—	—	Менее 9	Более 111
—	—	+	—
—	+	—	—
+	—	—	—
+	—	+	—
+	+	—	—
+	+	—	+
+	+	+	—	0,4
+	+	+	+	Более 2380	Менее 0,4

Определение термотолерантных колиформных бактерий (ТКБ)

ТКБ определяют теми же методами, как и БГКП, кроме последнего этапа идентификации, который проводится по ферментации лактозы на полужидкой питательной среде при 44,5°С. В случае роста на среде Эндо типичных лактозоположительных колоний, Гр(-), оксидазоотрицательных, способных ферментировать лактозу при 44,5°С, их учитывают как ТКБ, индекс или титр определяют по таблице 6.

Определение колифагов.

Присутствие колифагов (бактериофагов, паразитирующих на Е. coli) определяют методом агаровых слоев по Грациа.

Для определения используют чувствительные музейные культуры микроорганизмов (тест-организмы): мутант Salmonella tuphimurium, непатогенный для человека, штамм Escherichia coli К-12 Hfr из соответствующей коллекции культур АТСС 23631 или NTCT12486, штамм E.coli рода CN, называемый WG5, а также бактериофаги MS2, NCTC12487 или АТСС 15597 для контроля чувствительности тест-организмов.

За 18-24 часа перед проведением анализа необходимо сделать посев тест-культуры E.coli К₁₂ F+ на скошенный питательный агар (МПА). Перед проведением анализа сделать смыв с «косяка» 5 мл стерильной водопроводной воды и по стандарту мутности приготовить взвесь тест-организма в концентрации 10 9 бакт. клеток/мл.

В результате индикаторная культура образует равномерный сплошной рост, а при наличии колифагов в этом «газоне» образуются прозрачные бляшки («негативные колонии» бактериофага). Учет результатов проводят путем подсчета и суммирования бляшек, выросших на 5-ти чашкках Петри. Результаты выражают в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 100 мл воды. В контрольной пробе бляшки должны отсутствовать.

Определение спор сульфитредуцирующих клостридий.

Испытуемую воду вносят в расплавленную и остуженную среду Вильсона—Блера. Среда содержит тиосульфат (гипосульфит) и бесцветную соль железа. В результате прорастания спор, размножения клостридий и восстановления ими сульфита образуется сульфид железа, который придает среде черный цвет.

Количественно эти микроорганизмы в воде можно определить методом мембранной фильтрации или прямым посевом.

Перед посевом пробу воды прогревают на водяной бане при температуре 75±5°С в течение 15 мин для уничтожения вегетативных форм. При исследовании хлорированной воды, ее можно не прогревать. Применяя метод мембранной фильтрации, пробу воды определенного объема пропускают через фильтр, который затем помещается в пробирку с подготовленной расплавленной питательной средой верхней стороной внутрь (пробирка с питательной средой после посева должна быть немедленно охлаждена в холодной воде во избежание попадания воздуха) или в чашку Петри на поверхность питательной среды, которая затем заливается той же питательной средой толстым слоем.

Метод прямого посева предполагает посев в стерильные пробирки 20 мл воды следующим образом: по 10 мл в 2 пробирки (объемом не менее 30 мл), или по 5 мл в 4 пробирки (объемом не менее 15 мл).

Сверху посевы воды заливают горячим (75-80°С) железосульфитным агаром в количестве, превышающем объем воды в 2 раза. Среду заливают по стенке пробирки, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха. Пробирки с посевами быстро охлаждают в стакане с холодной водой, инкубируют при 44°С в течение 24 ч.

Количественному учету подлежат только те посевы, где получены изолированные колонии. Подсчитывают черные колонии, выросшие как на фильтре, так и в толще питательной среды. Результат анализа выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) спор сульфит-редуцирующих клостридий в определенном объеме воды (подвергнутой анализу).

Результат выражается в виде индекса (титра) БГКП, цифровое выражение которого определяют по таблицам: при анализе питьевой воды на выходе в водопроводную сеть и из нее – по табл. 5 и 6; при анализе воды на этапах очистки и обеззараживания – по табл. 7.

Давайте будем совместно делать уникальный материал еще лучше, и после его прочтения, просим Вас сделать репост в удобную для Вас соц. сеть.

---