Как правильно подготовиться к исследованию?

Не курить в течение 30 минут до сдачи крови.

Общая информация об исследовании

Этот тест выявляет антитела к Borrelia burgdorferi, которые вырабатываются организмом в ответ на заражение. То есть их наличие означает, что человек был инфицирован этими бактериями.

B. burgdorferi относится к группе спирохет и вызывает клещевой боррелиоз (болезнь Лайма).

Человек заражается, если его укусил клещ, который сам был инфицирован B. burgdorferi.

Иксодовые клещи, переносчики боррелиоза, очень распространены, в умеренном поясе Северного полушария они встречаются повсеместно. Чаще всего заражение людей происходит в период активности клещей – весной и летом.

Инкубационный период боррелиоза составляет несколько недель. На ранних стадиях могут наблюдаться следующие симптомы: усталость, озноб, головные боли. Также при боррелиозе иногда возникает характерная сыпь – мигрирующая эритема (кольцевидное покраснение кожи, которое постепенно расширяется). Если болезнь не лечить, то возможны серьезные проблемы: боль в суставах, менингит, онемение конечностей, паралич лицевого нерва, расстройства памяти и (в редких случаях) поражения глаз и сердца. Терапия болезни, как правило, эффективна.

При инфицировании лимфоциты человека начинают вырабатывать антитела – специальные белки (иммуноглобулины), которые должны нейтрализовать бактерии. Первыми в крови появляются иммуноглобулины M (IgM), но постепенно их концентрация уменьшается. Через некоторое время возникают антитела другого типа – иммуноглобулины G (IgG). Их можно выявить через несколько недель после инфицирования, а максимального уровня они достигают через 4-6 месяцев. Таким образом, антитела IgM указывают на недавнее заражение, а иммуноглобулины G подходят для более поздней диагностики.

Количество антител выражают в виде титра. Титр – это максимальное разбавление раствора, при котором в нем еще обнаруживаются антитела. Например, титр 1:16 означает, что, если сыворотку крови разбавить в 16 раз, в ней еще можно обнаружить антитела (а если разбавить сильнее – антитела уже не детектируются).

Титр называют высоким (например, 1:612) или низким (например, 1:4), конкретное его значение зависит от чувствительности метода.

Высокий титр с большей вероятностью указывает на заболевание, которое протекает в настоящее время (а не то, которое было в прошлом). Важно помнить, что титр не пропорционален тяжести заболевания, ведь речь идет не о количестве бактерий, а о количестве антител против них.

Выявление антител рекомендуется проводить в два этапа. Первый шаг – это измерение титра антител IgM и IgG. Если результат положительный или неоднозначный, то нужно сдать еще один анализ – иммуноблот.

Для чего используется исследование?

• Чтобы установить, был ли человек инфицирован бактериями Borrelia burgdorferi. Это позволяет подтвердить диагноз «клещевой боррелиоз».
• Чтобы контролировать эффективность лечения.

Когда назначается исследование?

Тест назначается при симптомах клещевого боррелиоза. На ранних стадиях могут отмечаться:

• мигрирующая эритема,
• повышенная температура, озноб,
• головная боль,
• быстрая утомляемость,
• тошнота.

Дополнительным показанием к анализу является укус клеща (за несколько дней или недель до появления первых симптомов). В ряде случаев даже удается проверить на B. burgdorferi самого клеща. Если результат положителен (т. е. клещ является переносчиком боррелиоза), то укушенному человеку следует сдать анализ самому (обнаружить антитела можно будет через несколько недель).

Симптомы боррелиоза на более поздних стадиях:

• периодическая боль в суставах, костях и мышцах,
• менингит,
• паралич лицевого нерва,
• онемение конечностей,
• расстройства памяти,
• поражения глаз и сердца (в редких случаях).

Кроме того, анализ назначается при необходимости убедиться в успешности лечения.

КП (коэффициент позитивности): 0 — 0,89.

• Боррелиоза нет. Инфекция отсутствует.
• Недавняя инфекция. Если заражение произошло недавно, то уровень антител может быть еще слишком низким, так что его не удалось обнаружить. При серьезном подозрении на боррелиоз необходимо провести дополнительные исследования.

• Боррелиоз. Возможное наличие инфекции B. burgdorferi в данный момент.
• Боррелиоз в прошлом. Вероятно, у человека в настоящее время нет клещевого боррелиоза. Однако он перенес это заболевание когда-то в прошлом, и с тех пор в крови сохранились антитела против B. burgdorferi.

Высокий титр антител указывает на первый вариант (т. е. подтверждает диагноз «боррелиоз»). Низкий титр характерен для боррелиоза в прошлом.

Определение титра IgG обычно используют в комплексе с другими тестами на антитела. Интерпретировать результаты следует в совокупности.

Изобретение относится к медицине, микробиологической промышленности и может быть использовано для получения методами генной инженерии рекомбинантных химерных полипептидов, несущих эпитопы различных иммунодоминантных белков спирохет комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato. Указанные полипетиды могут быть использованы для диагностики иксодового клещевого боррелиоза (Лайм-боррелиоз, болезнь Лайма) методами иммуноферментного анализа (ИФА), иммунохроматографического анализа и вестерн-блот анализа, а также для получения сывороток животных, содержащих поликлональные антитела к соответствующим рекомбинантным химерным полипептидам, и создания молекулярных вакцин против возбудителя иксодового клещевого боррелиоза.

рекомбинантные химерные полипептиды, несущие эпитопы различных иммунодоминантных белков спирохет комплекса borrelia burgdorferi sensu lato, и способ серодиагностики иксодового клещевого боррелиоза

G01N33/53 иммунологический анализ, анализ биоспецифического связывания, материалы для этого

G01N33/68 с использованием протеинов, пептидов или аминокислот

Изобретение относится к области медицины и касается рекомбинантных химерных полипептидов, несущих эпитопы различных иммунодоминантных белков спирохет комплекса Borellia Burgdorferisensu lato, и способа серодиагностики иксодового клещевого боррелиоза. Предложены рекомбинантные химерные полипептиды _rmBmpA- _frp83, _rmOspA-_frp83, _rm DbpB-_rmOspA, _rmFlaA-_frFlaB и _rmOspC_Bg—_rmOspC_Ba, полученные на основе экспрессии генов, амплифицированных методом ПЦР на ДНК западносибирского изолята Borrelia garinii 20047 T или, в случае белка rmOspC_Ba, на ДНК изолята Borrelia afzelii. Представленные изобретения расширяют арсенал рекомбинантных полипептидов, пригодных для серодиагностики иксодового клещевого боррелиоза, повышения специфичности и чувствительности диагностики ИКБ, в том числе дифференциальной диагностики ранней стадии и стадии диссеминированной инфекции в регионах распространения западносибирских изолятов Borrelia burgdorferi s.1., и могут быть использованы в качестве антигенов для иммуноферментного анализа. 6 н. и 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл., 5 пр.

Рисунки к патенту РФ 2514230

Изобретение относится к медицине, микробиологической промышленности и может быть использовано для получения методами генной инженерии рекомбинантных химерных полипептидов, несущих эпитопы различных иммунодоминантных белков спирохет комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato. Указанные полипетиды могут быть использованы для диагностики иксодового клещевого боррелиоза (Лайм-боррелиоз, болезнь Лайма) методами иммуноферментного анализа (ИФА), иммунохроматографического анализа и вестерн-блот анализа, а также для получения сывороток животных, содержащих поликлональные антитела к соответствующим рекомбинантным химерным полипептидам, и создания молекулярных вакцин против возбудителя иксодового клещевого боррелиоза.

Иксодовый клещевой боррелиоз (ИКБ) — это инфекционное трансмиссивное природноочаговое заболевание, вызываемое спирохетами комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato (B.burgdorferi s.l.), передающееся через иксодовых клещей. В настоящее время охарактеризовано 18 видов спирохет, входящих в состав комплекса В.burgdorferi s.l., из которых только четыре: В.burgdorferi sensu stricto, B.garinii, B.afzelii и B.spielmanii, являются патогенными для человека (1). По широте распространения и уровню заболеваемости ИКБ занимает одно из ведущих мест среди природно-очаговых заболеваний. Географическое распространение ИКБ обширно, оно встречается на всех континентах (кроме Антарктиды). В нашей стране природные очаги этой инфекции широко распространены в лесной зоне, от границ с Прибалтикой на западе до Южного Сахалина — на востоке (2). В России обнаружены четыре из шести видов боррелий, встречающихся в мире. Виды B.afzelii и B.garinii распространены по всей территории страны, от европейской части до Дальневосточного региона (3). B.burgdorferi sensu stricto обнаружена только на европейской части территории России — в Московской и Ленинградской областях (4, 5, 6). За последнее десятилетие проведены работы по изучению зараженности иксодовых клещей, распространенных на территории Западной Сибири, спирохетами комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato и определению видового состава боррелий (B.afzelii, B.garinii и, предположительно B.japonica, патогенность последнего не выявлена) (7, 8, 9).

Иксодовый клещевой боррелиоз представляет серьезную опасность для здоровья людей, поскольку может приводить к длительной нетрудоспособности и инвалидности. Клинически заболевание протекает с преимущественным поражением кожи, нервной системы, опорно-двигательного аппарата, сердца и характеризуется склонностью к хроническому, а также латентному течению (10).

Диагностика ИКБ является одной из актуальных проблем здравоохранения, и это обусловлено многими факторами: разнообразием клинических проявлений, наличием сопутствующих инфекций, возбудители которых переносятся иксодовыми клещами (анаплазмоз, бабезиоз, вирусный клещевой энцефалит и др.) (11), зависимостью проявлений инфекции как от видовой принадлежности возбудителя, так и от индивидуальных особенностей организма и др. На ранней стадии ИКБ хорошо поддается лечению антибиотикотерапией. На поздних стадиях лечение является более длительным и не всегда успешным. В раннем периоде развития ИКБ выделяют раннюю стадию инфекции (стадию локальной инфекции) и следующую за ней стадию дисссеминированной инфекции, соответствующую диссеминации боррелий в различные органы. Заболевание может иметь стертую клиническую картину течения или латентную форму или маскироваться под другие заболевания, что затрудняет его диагностику.

Основными методами, позволяющими быстро диагностировать ИКБ, являются методы, основанные на выявлении антител к возбудителю, при этом в качестве антигенов используют лизат боррелий или белки, входящие в их состав.

Известен лизат боррелий B.burgdorferi s.1., содержащий белки боррелий, которые используют в качестве антигенов для диагностики ИКБ (12). Недостатками использования антигенов в составе лизата боррелий является то, что лизат включает также белки теплового шока р75 и р60, имеющие гомологию аминокислотных последовательностей с белками, выполняющими сходные функции у ряда грам-отрицательных, грам-положительных микроорганизмов и микобактерий (13). Кроме того, флагеллин боррелий имеет общие эпитопы с флагеллинами других спирохет (T.pallidum, T.phagedenis B.persica, B.hermsii, B.duttoni и др.). Поэтому применение антигенов лизата боррелий в лабораторной практике приводит к получению ложноположительных результатов при тестировании сывороток больных сифилисом, пародонтозом, лептоспирозом, туберкулезом и многими другими заболеваниями (14). Специфичность анализа при использовании антигенов лизата боррелий невелика и составляет 60-70%.

Известны антигены внешних поверхностных белков и декорин-связывающих белков нативных штаммов боррелий (спирохет B.burgdorferi s.1.), которые используют для диагностики ИКБ (15). Однако при многократном пассировании культуры in vitro, боррелии теряют свои внехромосомные элементы (плазмиды), кодирующие иммунодоминантные белки, в том числе внешние поверхностные и декорин-связывающие белки. Это ограничивает количество получаемых антигенов ввиду небольшого числа циклов размножения возбудителя в условиях in vitro и делает их использование непрактичным.

В последние 15 лет для диагностики ИКБ в качестве антигенов используют иммунодоминантные белки возбудителей ИКБ, синтезируемые рекомбинантными штаммами Escherichia coli.

Известен лизат клеток Е.coli, продуцирующих поверхностный иммунодоминантный белок боррелий BmpA, используемый для диагностики ИКБ (16). Недостатком заявленного диагностического средства является то, что использование неочищенного из лизата белка BmpA существенно снижает чувствительность диагностики. Кроме того, он не может быть использован для диагностики ранней стадии ИКБ.

Известен рекомбинантный флагеллярный белок спирохет B.burgdorferi s.1. FlaA массой 38 кДа, используемый в качестве антигена для диагностики ИКБ на ранней стадии заболевания (17). Однако он не может быть использован для серодиагностики стадии диссеминированной инфекции ИКБ.

Известен рекомбинантный флагеллярный белок спирохет B.burgdorferi s.1. FlaB массой 41 кДа, используемый в качестве антигена для диагностики ИКБ, который вызывает иммунный ответ уже на ранних стадиях развития ИКБ, а иммуноглобулины к FlaB сохраняются в высоком титре на протяжении всей инфекции (18). Недостатком данного антигена является то, что он не позволяет дифференцировать раннюю стадию и стадию диссеминированной инфекции ИКБ.

Известен рекомбинантный белок OspC из семейства внешних поверхностных липопротеинов боррелий, используемый в качестве антигена для диагностики ИКБ (15), который является сильным иммунодоминантным белком B.burgdorferi s.1., индуцирующим гуморальный иммунный ответ на ранней стадии инфекции. Недостатком OspC является его непригодность для диагностики стадии диссеминированной инфекции ИКБ.

Известен рекомбинантный белок OspA из семейства внешних поверхностных белков боррелий, используемый в качестве антигена для диагностики ИКБ (19). Данный маркер позволяет диагностировать ИКБ с преимущественным поражением суставов на стадии диссеминированной инфекции, он не пригоден для диагностики ранней стадии ИКБ

Известна комбинация рекомбинантных белков OspA и VIsE (variable major protein-like sequence, expressed), совместно используемых в качестве антигенов для диагностики ИКБ на стадии диссеминированной инфекции. Данная комбинация антигенов недостаточна для исключения ложноположительной реакции у здоровых пациентов (20). Кроме того, она не позволяет диагностировать раннюю стадию ИКБ.

Известен рекомбинантный декоринсвязывающий белок (DbpA) боррелий, используемый в качестве антигена для диагностики ИКБ на стадии диссеминированной инфекции, что позволяет выявлять 100% больных с такой формой ИКБ, как нейроборрелиоз и 62% при ИКБ с преимущественным поражением суставов (21). Использование DbpA без сочетания с другими маркерами ИКБ не позволяет диагностировать раннюю стадию заболевания.

Диагностическую значимость для выявления ИКБ на стадии диссеминированной инфекции имеет также другой декоринсвязывающий белок боррелий — DbpB (22). Однако установлено, что использование декоринсвязывающих белков в качестве антигенов для диагностики ИКБ не позволяет диагностировать раннюю стадию заболевания (22).

Известен рекомбинантный белок боррелий ВтрА (р39) из семейства основных мембранных белков, используемый в качестве антигена для диагностики ИКБ на стадии диссеминированной инфекции. BmpA вызывает сильный иммунный ответ в организме. Зрелый белок BmpA имеет молекулярную массу около 39 кДа и является наряду с флагеллярными белками достаточно консервативным иммуногенным белком спирохет комплекса B.burgdorferi s. 1.: гомология аминокислотных последовательностей BmpA различных видов спирохет В.burgdorferi s.1., патогенных для человека и распространенных в Европе, составляет от 86% до 91% (23). Чувствительность диагностических тест-систем, основанных на использовании BmpA, полученного на основе одного вида боррелий зависит от распространенности данного вида в том регионе, в котором инфицирован пациент. Использование BmpA для диагностики ИКБ не позволяет выявлять раннюю стадию заболевания.

Известен рекомбинантный полипептид, включающий фрагмент аминокислотной последовательности (позиции 139-273) OspC боррелий штамма Borrelia burgdorferi sensu stricto, рекомбинантный полипептид, включающий фрагмент 160-170 указанной аминокислотной последовательности OspC, а также рекомбинантный химерный полипептид, включающий комбинацию фрагментов аминокислотных последовательностей OspC (1-164, 165-179, 180-216, 217-273) от четырех разных штаммов боррелий, которые могут быть использованы для получения молекулярных вакцин против ИКБ (24). Недостатком применения названных рекомбинантных полипептидов и химерного полипептида для диагностики ИКБ в Сибири является то, что источником генов для получения данных полипептидов являются типичные европейские изоляты боррелий, существенно отличающиеся по антигенным свойствам от спирохет, распространенных в Сибири. Кроме того, использование OspC или его фрагментов, в том числе в составе рекомбинантного химерного полипептида, для диагностики ИКБ не позволяет диагностировать стадию диссеминированной инфекции.

Известны рекомбинантные белки OspA, OspB, их фрагменты, рекомбинантный химерный полипептид OspA-OspB, полипептид FlaB, которые могут быть использованы для диагностики ИКБ (25). Недостатком применения названных рекомбинантных полипептидов для диагностики ИКБ в России является то, что они получены на основе генов североамериканских изолятов Borrelia burgdorferi sensu stricto (штаммы N40, В31 и ZS7), которые в России встречаются только в Московской и Ленинградской областях и отсутствуют на других территориях, в том числе в Сибири. Кроме того, выбранная структура гена flaB кодирует перекрестные эпитопы с флагеллярными белками других видов патогенов, главным образом, возбудителя сифилиса — Treponema palladium (29), что обусловливает получение ложноположительных результатов при использовании для диагностики рекомбинантного полипептида FlaB, кодируемого данным геном. Рекомбинантные белки, получаемые согласно данному аналогу, синтезируются слитыми с глутатионтрансферазой, что может приводить к искажениям результатов при диагностике ИКБ.

Известны рекомбинантные белки OspA и FlaB, кодируемые полноразмерными генами ospA и flab, полученными амплификацией методом ПЦР на ДНК североамериканского изолята Borrelia burgdorferi, штамм ZS7 (26). Недостатком применения их для диагностики ИКБ является то, что они обладают отличающимися антигенными свойствами, по сравнению с аналогичными полипептидами, кодируемыми генами изолятов боррелий, встречающихся на территории России, в частности в Сибири, что снижает эффективность использования основанных на их применении тест-систем диагностики ИКБ на территории России. Кроме того, как отмечено выше, OspA пригоден для диагностики ИКБ главным образом на стадии диссеминированной инфекции, и только к FlaB имеются антитела, как на ранней стадии заболевания, так и на стадии диссеминированной инфекции. Таким образом, совместное использование этих антигенов для серодиагностики ИКБ не обеспечивает надежную постановку диагноза на ранней стадии инфекции.

Известен рекомбинантный белок OspC, кодируемый геном, относящимся к инвазивным группам A, B, I и K Borrelia burgdorferi s.1. или группам A, B Borrelia afzelii (27). Недостатком применения данного полипептида для диагностики ИКБ в России является то, что он получен на основе гена боррелий, не встречающихся в популяциях иксодовых клещей на территории России. Кроме того, OspC не пригоден для диагностики ИКБ на стадии диссеминированной инфекции.

Известен рекомбинантный белок OspC, и рекомбинантный полипетид, соответствующий фрагменту белка FlaB западносибирского изолята B.garinii подгруппы NT29, совместно используемые в качестве антигенов для диагностики ИКБ. Недостатком фрагмента белка FlaB является то, что он содержит восемь дополнительных аминокислотных остатков зрелого -токсина Staphylococcus aureus, что дает при диагностике ИКБ ложноположительные результаты, т.е. не может обеспечить высокую специфичность диагностики ИКБ (28). Кроме того, сочетание двух указанных рекомбинантных полипептидов не обеспечивает надежной диагностики ИКБ на стадии диссеминированной инфекции, т.к. антитела к OspC нарабатываются у больных только на ранней стадии, и только антитела к FlaB могут присутствовать как на ранней стадии, так и на стадии диссеминированной инфекции.

Известен рекомбинантный белок FlaA вида B.burgdorferi s.s. (штамм В31), распространенного на североамериканском континенте и в странах Западной Европы (29). Недостатком применения этого белка для диагностики ИКБ в России является то, что он отличается по антигенным свойствам от белков FlaA, свойственных боррелиям, циркулирующим в популяциях иксодовых клещей на территории Сибири и Дальнего Востока. Кроме того, FlaA не пригоден для диагностики ИКБ на стадии диссеминированной инфекции.

Наиболее близкими к заявленным являются химерные рекомбинантные полипептиды, несущие эпитопы различного размера из белков OspA, свойственных видам североамериканских и европейских изолятов боррелий и одного или двух других рекомбинантных полипептидов указанных боррелий в следующих комбинациях: OspA и OspA, OspA-OspB, OspA-OspB-OspC, OspA-p83, а также химерные рекомбинантные полипептиды OspB-FlaB и OspB-FlaB-OspC (30). Применение названных химерных антигенов для диагностики ИКБ в Сибири не приемлемо ввиду следующих причин:

— в их состав входят преимущественно эпитопы высоковариабельных антигенов североамериканских и европейских изолятов боррелий, таких как: OspA, OspB и OspC, существенно отличающихся от аналогичных аминокислотных последовательностей сибирских изолятов боррелий, что обусловливает их различную аффинность к антителам сывороток больных и снижает чувствительность анализа;

— количество консервативных антигенов, по которым различия между видами боррелий различных регионов менее выражены, ограничивается белками р83 и FlaB, входящими в состав химерных антигенов OspA-p83, OspB-FlaB-OspC и OspB-FlaB, однако сочетание в составе одного рекомбинантного химерного полипептида маркеров ранней стадии и стадии диссеминированной инфекции затрудняет дифференциальную диагностику этих стадий заболевания.

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала рекомбинантных полипептидов, пригодных для диагностики ИКБ, повышение специфичности и чувствительности диагностики ИКБ в регионах распространения западносибирских изолятов Borrelia burgdorferi s.1., в том числе дифференциальной диагностики ранней стадии и стадии диссеминированной инфекции.

Решение поставленной задачи достигается тем, что предложены следующие новые рекомбинантные химерные полипептиды, полученные на основе экспрессии генов, синтезированных методом ПЦР на ДНК, выделенных из западносибирских изолятов B.garinii и B.afzelii:

1. Рекомбинантный химерный полипептид — _rmBmpA- _frp83 (SEQ ID NO 4) размером 591 а.о. с молекулярной массой 65,89 кДа, содержащий с N-конца молекулы аминокислотную последовательность зрелого белка BmpA западносибирского изолята Borrelia garinii (_rmBmpA) размером 324 а.о. с молекулярной массой 35,3 кДа, а с С-конца — аминокислотную последовательность C-концевого фрагмента белка р83 (_frp83) западносибирского изолята Borrelia garinii размером 248 а.о. с молекулярной массой 28,17 кДа.

2. Рекомбинантный химерный полипептид — _mOspA-_frp83 (SEQ ID NO 6) размером 521 а.о. с молекулярной массой 57,99 кДа, содержащий с N-конца молекулы аминокислотную последовательность рекомбинантного зрелого белка OspA (_rmOspA) западносибирского изолята Borrelia garinii размером 257 а.о. с молекулярной массой 27,79 кДа, а с С-конца — аминокислотную последовательность C-концевого фрагмента белка р83 (_frp83) западносибирского изолята Borrelia garinii размером 248 а.о. с молекулярной массой 28,17 кДа.

3. Рекомбинантный химерный полипептид — _rmDbpB- _rmOspA (SEQ ID NO 8) размером 432 а.о. с молекулярной массой 47,13 кДа, содержащий с N-конца молекулы аминокислотную последовательность рекомбинантного зрелого белка DbpB (_rmDbpB) западносибирского изолята Borrelia garinii размером 156 а.о. с молекулярной массой 17,02 кДа, а с С-конца — рекомбинантного зрелого белка OspA ( _rmOspA) западносибирского изолята Borrelia garinii размером 257 а.о. с молекулярной массой 27,79 кДа.

4. Рекомбинантный химерный полипептид — _rmFlaA-_frFlaB (SEQ ID NO 10) размером 587 а.о. с молекулярной массой 64,76 кДа, содержащий с N-конца молекулы аминокислотную последовательность рекомбинантного зрелого белка FlaA (rmFlaA) западносибирского изолята Borrelia garinii размером 318 а.о. с молекулярной массой 35,82 кДа, а с С-конца — аминокислотную последовательность фрагмента флагеллярного белка FlaB (_frFlaB) специфичного для спирохет B.burgdorferi s.1. размером 250 а.о. с молекулярной массой 26,62 кДа.

5. Рекомбинантный химерный полипептид — _rmOspC_Bg—_rmOspC_Ba (SEQ ID NO 12) размером 390 а.о. с молекулярной массой 40,83 кДа, содержащий с N-конца молекулы аминокислотную последовательность рекомбинантного зрелого белка OspC западносибирского изолята Borrelia garinii (_rmOspC_Bg) размером 188 а.о. с молекулярной массой 19,70 кДа, а с С-конца — аминокислотную последовательность рекомбинантного зрелого белка OspC западносибирского изолята Borrelia afzelii (_rmOspC_Ba) размером 186 а.о. с молекулярной массой 19,19 кДа.

В кратких обозначениях белков нижние индексы означают: «m» — зрелый (mature), «fr» — фрагмент «r» — рекомбинантный, Bg и Ba — принадлежность белка к боррелиям видов Borrelia garinii и Borrelia afzelii соответственно.

Известны способы серодиагностики иксодового клещевого боррелиоза методами иммуноферментного анализа с применением коммерческих тест-систем.

Известен способ серодиагностики ИКБ методом иммуноферментного анализа, включающий применение нативного антигена в виде лизата спирохет, полученного из штамма П1 В.afzelii, выделенного на территории Московской области (производитель:

Государственный научный центр прикладной микробиологии, г.Оболенск, Россия) (31). Недостатком известного способа является то, что он не обеспечивает удовлетворительной специфичности по отношению к ИКБ в регионах распространения западносибирских изолятов боррелий, т.к. они существенно отличаются по структуре антигенов от изолятов боррелий, распространенных в Московской области. Кроме того, способ не позволяет дифференцировать раннюю стадию и стадию диссеминированной инфекции. Использование лизатов спирохет обеспечивает высокую чувствительность способа, но он обладает очень низкой специфичностью ввиду присутствия в лизатах антигенов, имеющих перекрестную антигенную реактивность с антигенами других микроорганизмов, включая симбионтов человека. Кроме того, получение лизатов связано с дорогостоящим культивированием спирохет, причем в процессе нескольких пассажей спирохеты могут терять антигены, кодируемые плазмидными ДНК этих микроорганизмов.

Известен способ серодиагностики ИКБ методом иммуноферментного анализа, включающий применение природного антигена, выделенного из штамма РКо В.afzelii (производитель тест-системы: «Dade Behring Marburg GmbH», Германия) (32). Известный способ обладает теми же недостатками.

Известен способ серодиагностики ИКБ методом иммуноферментного анализа, включающий применение в качестве антигенов смеси следующих рекомбинантных полипептидов трех видов боррелий: р21 и OspC из В.burgdorferi sensu stricto и В.garinii, p41i — внутренняя часть флагеллина, из В.garinii, p18 и р100 из В.afzelii (производитель: «Biomedica», Австрия) (33). Недостатком заявленного способа является то, что известные антигены получены на основе боррелий, распространенных в Западной Европе, что ограничивает его применение на территориях, где распространены западносибирские изоляты боррелий. Кроме того, известный способ не позволяет дифференцировать раннюю стадию и стадию диссеминированной инфекции. Другим недостатком способа является то, что использование трех-четырех антигенов недостаточно для достижения высокой чувствительности и специфичности способа.

Известен способ серодиагностики ИКБ методом иммуноферментного анализа, включающий применение в качестве антигенов рекомбинантного полипептида VlsE и лизата клеток В.afzelii, В.arinii для диагностики стадии диссеминированной инфекции ИКБ (выявления антител к боррелиям класса IgG), рекомбинантного полипептида FlaB и природного очищенного OspC для диагностики ранней стадии ИКБ (для выявления антител к боррелиям класса IgM) (производитель тест-ситемы: компания «NovaTec GmbH», Германия) (34). Недостатком заявленного способа является то, что известные антигены получены на основе боррелий, распространенных в Западной Европе, что ограничивает его применение на территориях, где распространены западносибирские изоляты боррелий. Использование лизатов клеток обеспечивает высокую чувствительность способа, но он обладает очень низкой специфичностью ввиду присутствия в лизатах антигенов, имеющих перекрестную антигенную реактивность с антигенами других микроорганизмов.

Известен способ серодиагностики ИКБ инфекции методом иммуноферментного анализа, включающий применение в качестве антигенов смеси рекомбинантных полипетидов трех видов боррелий: VlsE из В.burgdorferi sensu stricto, FlaB (p41) и BmpA из В.garinii, OspC из В.afzelii (производитель: ЗАО «Вектор-Бест», г.Новосибирск, Россия). Известный способ является недостаточно чувствительным и специфичным, в том числе на территории Сибири. Это обусловлено небольшим количеством используемых антигенов, а также использованием в качестве антигенов рекомбинантных белков боррелий, которые не встречаются на территории Сибири (B.burgdorferi sensu stricto) либо существенно отличаются по аминокислотной последовательности от белков западносибирских изолятов боррелий. Кроме того, в способе используют рекомбинантный белок OspC только вида В.afzelii, который в Сибири менее распространен, чем В.garinii.

Наиболее близким к заявляемому является способ серодиагностики ИКБ методом иммуноферентного анализа, включающий применение в качестве антигенов смеси рекомбинантных антигенов DbpA из В.afzelii и В.garinii, FlaB (p41) из В.garinii, OspC из В.afzelii и В.garinii, p35 из В.afzelii (производитель тест-ситемы: ООО «Омникс», г.Санкт-Петербург, Россия) (31). Поскольку он основан на антигенах, свойственных европейским изолятам боррелий, то обладает сниженной чувствительностью и специфичностью при диагностике ИКБ, вызываемого боррелиями, циркулирующими на территории Сибири. Кроме того, он недостаточно надежно выявляет ИКБ на ранней стадии, т.к. для этого используется только один маркер — OspC. Наличие же в сыворотке антител к FlaB встречается у пациентов как на ранней стадии, так и на стадии диссеминированной инфекции.

Задачей, на решение которой направлено изобретение, является повышение специфичности и чувствительности способа диагностики ИКБ, дифференциальной диагностики ранней стадии и стадии диссеминированной инфекции ИКБ на территории распространения западносибирских изолятов Borrelia burgdorferi s.1.

Решение поставленной задачи достигается тем, что в качестве антигенов для иммуноферментного анализа используют рекомбинантные химерные полипептиды _rmBmpA-_fr p83, _rmOspA-_frp83, _rmDbpB- _rmOspA, _rmFlaA-_frFlaB, _rm OspC_Bg—_rmOspC_Ba, заявленные в настоящем изобретении, полученные на основе ДНК западносибирских изолятов Borrelia garinii, Borrelia afzelii; для диагностики ИКБ на ранней стадии используют рекомбинантные химерные полипептиды _rmFlaA-_frFlaB и _rmOspC_Bg —_rmOspC_Ba;

для диагностики ИКБ на стадии диссеминированной инфекции — рекомбинантные химерные полипептиды _rmBmpA-_frp83, _rm OspA-_frp83 и _rmDbpB-_rmOspA.

Описание сущности изобретения

Согласно заявленному изобретению предложены следующие новые рекомбинантные химерные полипептиды, пригодные для диагностики иксодового клещевого боррелиоза на территории распространения западносибирских изолятов боррелий:

1. Рекомбинантный химерный полипептид — _rmBmpA-_frp83 (SEQ ID NO 4) размером 591 а.о. с молекулярной массой 65,89 кДа, содержащий с N-конца молекулы аминокислотную последовательность рекомбинантного зрелого белка BmpA (_rmBmpA) западносибирского изолята Borrelia garinii размером 324 а.о. с молекулярной массой 35,3 кДа, а с С-конца — аминокислотную последовательность С-концевого фрагмента белка р83 (_frp83) западносибирского изолята Borrelia garinii размером 248 а.о. с молекулярной массой 28,17 кДа.

2. Рекомбинантный химерный полипептид — _rmOspA- _frp83 (SEQ ID NO 6) размером 521 а.о. с молекулярной массой 57,99 кДа, содержащий с N-конца молекулы аминокислотную последовательность рекомбинантного зрелого белка OspA (_rmOspA) западносибирского изолята Borrelia garmii размером 257 а.о. с молекулярной массой 27,79 кДа, а с С-конца — аминокислотную последовательность С-концевого фрагмента белка р83 (_frp83) западносибирского изолята Borrelia garinii размером 248 а.о. с молекулярной массой 28,17 кДа.

3. Рекомбинантный химерный полипептид — _rmDbpB-_rmOspA (SEQ ID NO 8) размером 432 а.о. с молекулярной массой 47,13 кДа, содержащий с N-конца молекулы аминокислотную последовательность рекомбинантного зрелого белка DbpB (_rmDbpB) западносибирского изолята Borrelia garmii размером 156 а.о. с молекулярной массой 17,02 кДа, а с С-конца — аминокислотную последовательность рекомбинантного зрелого белка OspA (_rmOspA) западносибирского изолята Borrelia garmii размером 257 а.о. с молекулярной массой 27,79 кДа.

4. Рекомбинантный химерный полипептид — _rmFlaA- _frFlaB (SEQ ID NO 10) размером 587 а.о. с молекулярной массой 64,76 кДа, содержащий с N-конца молекулы аминокислотную последовательность рекомбинантного зрелого белка FlaA (_rm FlaA) западносибирского изолята Borrelia garmii размером 318 а.о. с молекулярной массой 35,82 кДа, а с С-конца — аминокислотную последовательность фрагмента флагеллярного белка FlaB (_fr FlaB) специфичного для спирохет B.burgdorferi s.1. размером 250 а.о. с молекулярной массой 26,62 кДа.

5. Рекомбинантный химерный полипептид — _rmOspC_Bg—_rm OspC_Ba (SEQ ID NO 12) размером 390 а.о. с молекулярной массой 40,83 кДа, содержащий с N-конца молекулы аминокислотную последовательность рекомбинантного зрелого белка OspC западносибирского изолята Borrelia garmii (_rmOspC_Bg) размером 188 а.о. с молекулярной массой 19,70 кДа, а с С-конца — аминокислотную последовательность рекомбинантного зрелого белка OspC западносибирского изолята Borrelia afzelii (_rmOspC_Ba) размером 186 а.о. с молекулярной массой 19,19 кДа.

Предложенные рекомбинантные химерные полипептиды позволяют существенно расширить арсенал средств, которые могут быть использованы для диагностики ИКБ. Они пригодны в качестве антигенов для диагностики ИКБ на территориях распространения западносибирских изолятов боррелий, т.к. они созданы на основе ДНК боррелий этих регионов. Одновременное использование при диагностике ИКБ заявленных рекомбинантных химерных полипепидов, включающих в составе химер различные комбинации из 8 белков западносибирских изолятов боррелий, позволяет обеспечить высокую специфичность и чувствительность диагностики. Повышение специфичности и чувствительности дифференциальной диагностики ранней стадии и стадии диссеминированной инфекции ИКБ обеспечивается тем, что в состав рекомбинантных химерных полипептидов согласно пп.1-3 входят 4 маркера стадии диссеминированной инфекции, а рекомбинантны химерные полипептиды по пп.4, 5 включают 4 маркера ранней стадии ИКБ.

Заявленные рекомбинантные химерные полипептиды получены следующим образом.

Экспрессирующий вектор pET36b (+) («Novagen», США) был модифицирован путем встраивания под регуляторную область промотора бактериофага Т7 полилинкера, представляющего из себя фрагмент ДНК, содержащий сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции EcoRI, KpnI, BssHII, BstEII, HindIII и XhoI. Такая структура полилинкера была получена для удобства клонирования выбранных генов боррелий. За полилинкером следует нуклеотидная последовательность, кодирующая 8-ми гистидиновый аминокислотный фрагмент в C-концевой области рекомбинантных белков. Это позволяет очищать рекомбинантные полипептиды с помощью аффинной хроматографии на металло-хелатных сорбентах. Модифицированный вектор был назван pETm, структура встроенного полилинкера приведена в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO 1. Целевые рекомбинантные полипептиды, получаемые с помощью модифицированного экспрессирующего вектора pETm, не содержат протяженных чужеродных аминокислотных последовательностей, вследствие чего не дают неспецифических сигналов в иммуноферментных анализах. Это, в свою очередь, обеспечивает повышение специфичности диагностики.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pETm размером 5305 п.н. содержит:

— фрагмент ДНК размером 48 п.н. — полилинкер, содержащий сайты рестрикции EcoRI, KpnI, BssHII, BstEII, HindIII;

— уникальные сайты рестрикции XbaI, FauNDI, EcoRI, BssHII, BstEII, KpnI, HindIII, XhoI, DraIII, XmaI, SapI;

— XhoI-FauNDI фрагмент плазмидной ДНК pET36b (+) размером 5257 п.н., включающий:

1) фрагмент ДНК размером 47 п.н., содержащий последовательность терминатора транскрипции гена 10 бактериофага Т7;

2) фрагмент ДНК размером 468 п.н., содержащий ориджин репликации однонитчатого бактериофага f1;

3) фрагмент ДНК, размером 813 п.н., содержащий ген неомициптрансферазы, обусловливающей устойчивость клеток E.coli к капамицину;

4) фрагмент ДНК размером 468 п.н., содержащий ориджин репликации плазмиды рМВ1;

5) фрагмент ДНК размером 1080 п.н., кодирующий область гена-регулятора lacI оперона lac E.coli;

6) фрагмент ДНК размером 468 п.н., содержащий промотор гена 10 бактериофага Т7.

Структура вектора pETm приведена в перечне последовательностей под номером SEQ ID NO 2.

Вектор pETm был использован для клонирования и экспрессии индивидуальных генов (или фрагментов генов) белков _rmOspC_Bg, _rmDbpB, _rmOspA, _rmFlaA, _frFlaB, _rmBmpA и _frp83, свойственных западносибирским изолятам Borrelia garinii, белка _rmOspC_Ba западносибирского изолята Borrelia afzelii, а также химерных генов данных белков в заявленных сочетаниях.

В настоящем изобретении были получены и клонированы в составе вектора pETm рекомбинантные химерные ДНК, кодирующие рекомбинантные химерные полипептиды следующего состава: _rmBmpA-_fr p83, _rmOspA-_frp83, _rmDbpB- _rmOspA, _rmFlaA-_frFlaB и _rm OspC_Bg—_rmOspC_Ba. В кратких обозначениях белков нижние индексы означают: «m» — зрелый (mature), «fr» — фрагмент, Bg и Ba — принадлежность белка к боррелиям видов Borrelia garinii и Borrelia afzelii соответственно.

Аналогичным образом были названы рекомбинантные химерные ДНК, кодирующие вышеперечисленные полипептиды. Сконструированные плазмиды, содержащие рекомбинантные химерные ДНК, были названы соответственно: pETm-_rmbmpA-_frp83, pETm- _rmospA-_frp83, pETm-_rmdbpB-_rm ospA, pETm-_rmflaA-_frflaB и pETm-_rm ospC_Bg—_rmospC_Ba.

Рекомбинантная химерная ДНК _rmbmpA-_frp83 в составе вектора pETm обеспечивает синтез рекомбинантного химерного полипептида, содержащего эпитопы иммунодоминантных белков _rmBmpA и _frp83, специфичных для сибирского изолята В.garinii подгруппы 20047 T . Рекомбинантная химерная ДНК _rmbmpA-_frp83 имеет размер 1773 п.н. и включает следующие элементы (все позиции нуклеотидных остатков указаны относительно плазмиды pETm-_rmbmpA-_fr p83):

— фрагмент гена bmpA B.garinii размером 972 п.н., кодирующий рекомбинантный зрелый белок BmpA (_rm BmpA) западносибирского изолята Borrelia garimi, позиция фрагмента 5097-6068 п.н.;

— сайты эндонуклеазы рестрикции XhoI размером 6 п.н., позиции сайтов 6069-6074 п.н. и 6819-6824;

— фрагмент гена р83 B.garinii размером 744 п.н., кодирующий C-концевой фрагмент белка р83 западносибирского изолята Borrelia garimi (_frp83), позиции фрагмента 6075-6818 п.п.;

— уникальные сайты рестрикции: KpnI (GGTACC), позиция сайта 5091-5096; BglII (AGATCT) позиция сайта 5454-5459 п.н.; HindIII (AAGCTT) позиции 6522-6527 п.н.

Структура рекомбинантной химерной ДНК _mbmpA-_fr p83 представлена в перечне последовательностей SEQ ID NO 3, кодируемая ею аминокислотная последовательность рекомбинантного химерного полипептида _mBmpA-_frp83 отдельно представлена под номером SEQ ID NO 4.

Рекомбинантная химерная ДНК _rmospA-_frpSS в составе вектора pETm обеспечивает синтез рекомбинантного химерного полипептида, содержащего эпитопы иммунодоминантных белков _rmOspA и _fr p83, специфичных для сибирского изолята В.garinii подгруппы 20047 T . Рекомбинантная химерная ДНК _rmospA-_fr p83 имеет размер 1563 п.н. и включает следующие элементы (все позиции нуклеотидных остатков указаны относительно плазмиды pETm- _rmospA-_frp83):

— фрагмент гена ospA B.garinii размером 771 п.н., кодирующий рекомбинантный зрелый белок OspA западносибирского изолята Borrelia garimi (_rm OspA), позиция фрагмента 5088-5858 п.н.;

— сайты эндонуклеазы рестрикции XhoI размером 6 п.н., позиции сайтов 5859-5864 п.н. и 6609-6614;

— фрагмент гена р83 B.garinii размером 744 п.н., кодирующий C-концевой фрагмент белка р83 западносибирского изолята Borrelia garinii (_fr p83), позиции фрагмента 5865-6608 п.п.;

— уникальные сайты рестрикции: EcoRI (GAATTC), позиция сайта 5081-5086; BamHI (GGATTC), позиция сайта 5496-5501 п.н.; BglII (AGATCT), позиция сайта 5828-5833 п.н.; HindIII (AAGCTT), позиция сайта 6312-6317 п.н.

Структура рекомбинантной химерной ДНК _rmospA-_frp83 представлена в перечне последовательностей SEQ ID NO 5, кодируемая ею аминокислотная последовательность рекомбинантного химерного полипептида _rmOspA- _frp83 отдельно представлена под номером SEQ ID NO 6.

Рекомбинантная химерная ДНК _rmdbpB- _rmospA в составе вектора pETm обеспечивает синтез рекомбинантного химерного полипептида, содержащего эпитопы иммунодоминантных белков _rmDbpB и _rmOspA, специфичных для сибирского изолята B.garinii подгруппы 20047 T . Рекомбинантная химерная ДНК _rmbpB-_rmOspA имеет размер 1296 п.н. и включает следующие элементы (все позиции нуклеотидных остатков указаны относительно плазмиды pETm-_rmdbpB- _rmospA):

— фрагмент гена _rmdbpB B.garinii размером 468 п.н., кодирующий зрелый белок _rm DbpB, позиция фрагмента 5097-5564 п.н.;

— сайты эндонуклеазы рестрикции XhoI размером 6 п.н., позиции сайтов 5565-5570 п.н. и 6342-6347;

— фрагмент гена _rmospA B.garinii размером 771 п.н., кодирующий зрелый белок _rmOspA, позиции фрагмента 5571-6341 п.н.;

— уникальные сайты рестрикции: EcoRI (GAATTC), позиция сайта 5081-5086; KpnI (GGTACC), позиция сайта 5091-5096; BamHI (GGATTC), позиция сайта 5979-5984 п.н.; BglII (AGATCT) позиция сайта 6311-6316 п.н.

Структура рекомбинантной химерной ДНК _rmdbpB-_rmospA представлена в перечне последовательностей SEQ ID NO 7, кодируемая ею аминокислотная последовательность рекомбинантного химерного полипептида _rmDbpB- _rmOspA отдельно представлена под номером SEQ ID NO 8.

Рекомбинантная химерная ДНК _rmflaA- _frflaB в составе вектора pETm обеспечивает синтез рекомбинантного полипептида, содержащего эпитопы иммунодоминантных белков _frFlaB и _rmFlaA, специфичные для сибирского изолята B.garinii подгруппы 20047 T . Рекомбинантная химерная ДНК _rmflaA-_frflaB имеет размер 1761 п.н. и включает следующие элементы (все позиции нуклеотидных остатков указаны относительно плазмиды рЕТ- _rmflaA- _frflaB):

— фрагмент гена flaA B.garinii размером 954 п.н., кодирующий зрелый белок _rmFlaA позиция фрагмента 5097-6050 п.п.;

— сайты эндонуклеазы рестрикции XhoI размером 6 п.н., позиции сайтов 6051-6056 п.н. и 6807-6812 п.н.;

— фрагмент кодирующей области гена flaB B.garinii размером 756 п.н., позиции фрагмента 6057-6812 п.н.;

— уникальные сайты рестрикции — EcoRI (GAATTC) позиция сайта 5081-5086 п.н. и KpnI (GGTACC), позиции сайта 5091-5096 п.н.

Структура рекомбинантной химерной ДНК _rmflaA-_frflaB представлена в перечне последовательностей SEQ ID NO 9, кодируемая ею аминокислотная последовательность рекомбинантного химерного полипептида _rmFlsA- _frFlaB отдельно представлена под номером SEQ ID NO 10.

Рекомбинантная химерная ДНК _rmospC _Bg—_rmospC_Ba в составе вектора pETm обеспечивает синтез рекомбинантного химерного полипептида, содержащего эпитопы иммунодоминантных белков _rmOspC_Bg и _rmOspC_Ba, специфичных для сибирского изолята B.garinii подгруппы 20047 T и B.afzelii соответственно. Рекомбинантная химерная ДНК _rmospC_Bg— _rmospC_Ba имеет размер 1170 п.н. и включает следующие элементы (все позиции нуклеотидных остатков указаны относительно плазмиды pETm- _rmospC_Bg—_rmospC _Ba):

— фрагмент гена _rmospC _Bg B.garinii размером 564 п.н., кодирующий зрелый белок _rmOspC_Bg, позиция фрагмента 5088-5651 п.н.;

— фрагмент гена _rmospC_Ba B.afzelii размером 558 п.н., кодирующий зрелый белок _rmOspC _Ba, позиции фрагмента 5658-6215 п.н.;

— уникальные сайты рестрикции — EcoRI (GAATTC), позиция сайта 5081-5086; KpnI (GGTACC), позиция сайта 5652-5657 п.н.; XhoI (CTCGAG), позиция сайта 6216-6221 п.н.

Структура рекомбинантной химерной ДНК _rmospC_Bg—_rmospC _Ba представлена в перечне последовательностей SEQ ID NO 11, кодируемая ею аминокислотная последовательность рекомбинантного химерного полипептида _rmOspC_Bg—_rm OspC_Ba отдельно представлена под номером SEQ ID NO 12.

Заявленный способ серодиагностики иксодового клещевого боррелиоза методом иммуноферментного анализа включает использование в качестве антигенов комбинации заявленных согласно изобретению рекомбинантных химерных полипептидов _rm BmpA-_frp83, _rmOspA-_frp83, _rmDbpB-_rmOspA, _rmFlaA-_fr FlaB, _rmOspC_Bg—_rmOspC_Ba , полученных на основе экспрессии генов, синтезированных методом ПЦР на ДНК западносибирского изолята Borrelia garinii или в случае белка _rmOspC_Ba на ДНК изолята Borrelia afzelii. Для серодиагностики ранней стадии ИКБ используют рекомбинантные химерные полипептиды _rmFlsA-_frFlaB, _rmOspC_Bg—_rmOspC_Ba; для серодиагностики стадии диссеминированной инфекции ИКБ — рекомбинантные химерные полипептиды _rmBmpA-_frp83, _rmOspA-_frp83, _rmDbpB-_rm OspA. Сравнение аминокислотных последовательностей антигенов западносибирских изолятов боррелий, используемых в заявленном способе, с первичными структурами аналогичных антигенов, свойственных трем патогенным видам боррелий, распространенных в Западной Европе, Северной Америке и Азии, выявило в разной степени выраженные различия между ними: для антигена _rmOspA различия в аминокислотной последовательности составили от 26,9% до 64%, для _rmDbpB — от 17% до 46,5%, для _rmFlaA — от 1,5% до 4%, для _frFlaB — от 2% до 5%, для _rmBmpA — от 5,8% до 13,8%, для _frp83 — от 3,3% до 22,6%, для _rmOspC_Ba — от 56% до 72,3%, для _rmOspC_Bg — от 70% до 84,3%.

Способ осуществляют на основе стандартного метода твердофазного иммуноферментного анализа (Пример 5 конкретного выполнения). Заявленный способ серодиагностики иксодового клещевого боррелиоза демонстрирует высокую диагностическую чувствительность и специфичность при выявлении ИКБ в Западной Сибири, которые обусловлены следующими факторами:

а) прежде всего за счет использования химерных белков, включающих антигены, свойственные боррелиям, распространенным непосредственно на территории Западной Сибири, поскольку известно, что отличия в аминокислотных последовательностях аналогичных антигенов, свойственных изолятам боррелий разных географических зон, обуславливают необходимость использования в диагностических тестах антигенов, свойственных боррелиям, распространенным в соответствующих географических зонах;

б) используемые в анализе заявляемые химерные полипептиды состоят из полноразмерных природных аминокислотных последовательностей зрелых иммунодоминантных антигенов, содержащих полный набор соответствующих им В-эпитопов (исключение составляет иммунодоминантный С-концевой фрагмент белка р83);

в) использование в анализе одновременно 8 антигенов не снижает чувствительность анализа, поскольку в сенсибилизации лунок планшет участвуют, по существу, пять химерных антигенов, а не 8 входящих в их состав индивидуальных антигенов;

г) химерный полипептид _mOspC_Bg —_mOspC_Ba содержит аминокислотные последовательности двух иммунодоминантных высоко вариабельных антигенов, свойственных спирохетам B.garinii и B.afzelii, циркулирующим на территории Западной Сибири.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.

Перечень фигур и иных материалов

Фиг.1. Физико-генетическая карта рекомбинантной плазмидной ДНК pETm. lacI — кодирующая область гена-регулятора lacI оперона lac E.coli; T7-promotor — промотор гена 10 бактериофага Т7; TV-start — точка инициации транскрипции в промоторсодержащей области бактериофага Т7; lac-operator — последовательность, связывающая репрессор транскрипции гена lacZ; RBS — рибосомосвязывающий сайт (последовательность Шайна-Дальгарно); His-Tag — последовательность, кодирующая восемь гистидиновых а.о.; Т7-terminator — последовательность терминатора транскрипции гена 10 бактериофага Т7; Ori-pBR322 — ориджин репликации плазмиды pBR322; Kan — ген неомицин-фосфотрансферазы II, обусловливающей устойчивость клеток E.coli к канамицину.

Фиг.2. Электрофореграмма фракций, полученных в процессе аффинной хроматографии на Ni-хелатном сорбенте в денатурирующих условиях лизата клеток E.coli, продуцирующих химерный полипептид _rmBmpA-_frp83. Дорожки: (1) — лизат клеток продуцента после индукции; (2) — растворимая фракция лизата клеточной биомассы; (3) — фракция белков, несвязавшихся со смолой; (4-5) — элюаты, содержащие имидазол с конечной концентрацией 20 мМ и 50 мМ, соответственно; (6-8) — элюаты, содержащие имидазол с конечной концентрацией 250 мМ; (9-13) — элюаты, содержащие имидазол с конечной концентрацией 500 мМ, (14) — маркерные белки (66 и 28 кДа).

Таблица 1. Нуклеотидные последовательности праймеров, используемых для амплификации генов B.burgdorferi s.1. (сайт рестрикции подчеркнут).

Таблица 2. Условия амплификации фрагментов генов B.burgdorferi s.1.

Таблица 3. Выявление методом ИФА в сыворотках больных ИКБ и здоровых доноров антител классов IgM и IgG к рекомбинантным химерным антигенам боррелий.

Примеры конкретного выполнения

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.

Пример 1. Конструирование плазмидного вектора pETm.

Для конструирования экспрессирующего вектора pETm используют вектор pET36b (+) и синтетический дуплекс ДНК — полилинкер. Синтетический дуплекс ДНК в своей структуре содержит набор уникальных сайтов рестрикции: EcoRI, KpnI, BssHII, BstEII, HindIII. За синтетическим дуплексом следует участок, кодирующий восьмигистидиновую аминокислотную последовательность и стоп-кодон терминации трансляции мРНК. При этом продукты экспрессии встраиваемых в сконструированный вектор генов содержат дополнительно 8-ми гистидиновую аминокислотную последовательность в C-концевой области полипептидной цепи, что позволяет осуществлять аффинную очистку полипептидов на металлохелатных сорбентах. Синтетический дуплекс ДНК получают гибридизацией пары комплементарных друг другу олигонуклеотидов размером 53 и 55 п.п., структуры олигонуклеотидов приведены в перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO 13 и 14 соответственно. Олигонуклеотиды синтезированы таким образом, что при гибридизации образуется двунитевой фрагмент ДНК, содержащий на 5' и 3' концах «липкие концы» для эндонуклеаз рестрикции FauNDI nXhoI соответственно (сайты подчеркнуты):

FauNDI XhoI TATGCAGAATTCTATGGGTACCGTTGCGCGCAGCGGTCACCCGAAGCTTCTGCACGTCTTAAGATACCCATGGCAACGCGCGTCGCCAGTGGGCTTCGAAGACGAGCT

Гибридизацию олигонуклеотидов проводят следующим образом. В эквимолярном соотношении смешивают олигонуклеотиды в одной пробирке, нагревают пробирку на водяной бане и постепенно остужают раствор при комнатной температуре. Полученный раствор, содержащий синтетический дуплекс, используют для лигировапия с XhoI-FauNDI фрагментом плазмидной ДНК pET36b(+). Все процедуры, связанные со встройкой и клонированием дуплекса, а в последующем и ампликонов генов проводят с использованием стандартных генно-инженерных методик, описанных в руководстве (36).

Для получения фрагмента, плазмидную ДНК pET36b(+) гидролизуют эндонуклеазами рестрикции FauNDI и XhoI. Линейную форму плазмидной ДНК размером 5252 п.н. — фрагмент XhoI-FauNDI, отделяют от продуктов гидролиза в 0,8% агарозном геле. Необходимый фрагмент плазмидной ДНК вырезают из агарозного геля и извлекают ДНК с помощью набора фирмы «Биосилика» (Новосибирск, Россия) согласно прилагаемому протоколу. Очищенный фрагмент ДНК XhoI-FanNDI плазмиды pET36b(+) лигируют с синтетическим дуплеком ДНК. Лигирование проводят в молярном соотношении 20:1 (вставка / фрагмент XhoI-FauNDI) с помощью Т4 ДНК-лигазы фирмы «Сибэнзим» (Россия) согласно инструкции производителя фермента. Лигазной смесью методом электропорации трансформировали клетки E.coli штамма BL21 (DE3). Трансформацию клеток E.coli лигазной смесью проводят в соответствии с руководством фирмы-производителя электропоратора — «PeqLab, Biotechnologie GmbH» (Германия). Трансформированные клетки рассевают на агаризованую среду Луриа-Бертани (LB), содержащую канамицин 30 мкг/мл и выращивают в течение ночи при 37°С. Полученные клоны клеток анализируют на наличие вставки синтетического дуплекса с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием внешних праймеров PR268 и PR269, т.е. праймеров, лежащих «левее» и «правее» области встроенного синтетического фрагмента ДНК. Структуры праймеров PR268 и PR269 указаны в перечне последовательностей под номерами SEQ ID NO 15 и 16 соответственно. Для ПЦР использовали Taq ДНК- полимеразу «Сибэнзим» (Россия).

1 цикл (96°С — 2 мин, 64°С — 0,5 мин, 72°С — 0,5 мин);

25 циклов (96°С — 0,5 мин, 64°С — 0,5 мин, 72°С — 0,5 мин);

1 цикл (96°С — 0,5 мин, 64°С — 5 мин, 72°С — 10 мин).

Нужные клоны идентифицируют по размеру ампликона — продукта ПЦР, который должен составлять 296 п.н. Продукты ПЦР анализируют в 2% агарозном геле. Из нескольких положительных клонов выделяют плазмиды щелочным методом и используют для рестрикционного анализа ферментами, сайты для которых присутствуют только во встроенном полилинкере. Плазмидную ДНК одного из клонов, удовлетворяющую всем условиям, секвенируют для подтверждения нуклеотидной последовательности клонированного синтетического фрагмента ДНК. Новая конструкция плазмидной ДНК названа pETm, ее используют в дальнейшем для клонирования кодирующих областей генов спирохет комплекса B.burgdorferi sensu lato. Физико-генетическая карта плазмидного вектора pETm представлена на Фиг.1. Нуклеотидная последовательность вектора — в перечне последовательностей SEQ ID NO 2.

Пример 2. Конструирование рекомбинантных химерных ДНК, содержащих в составе плазмидного вектора pETm нуклеотидные последовательности, кодирующие рекомбинантные химерные иммунодоминантные белки спирохет комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato.

Кодирующие области генов заявленных рекомбинантных химерных полипептидов получают в препаративных количествах с помощью амплификации соответствующих фрагментов геномной ДНК спирохет B.garinii и B.afzelii методом ПЦР. В качестве матрицы используют геномные ДНК, полученные ранее из культур B.garinii и B.afzelii (37).

Праймеры для амплификации кодирующих областей генов подбирают исходя из сравнения известных нуклеотидных последовательностей, опубликованных в базах данных Интернета (GenBank). На основании сравнения выбирают наиболее консервативные участки, чтобы вероятность того, что праймер окажется комплементарен участку гена западносибирских изолятов боррелий, была высокой. Структуры подобранных праймеров представлены в табл.1. Каждый праймер на 5'-конце содержит последовательность, кодирующую сайт узнавания какой-либо эндонуклеазой рестрикции.

Амплификацию генов проводят с Pfu-ДНК полимеразой, фирмы «Сибэнзим» (Россия) согласно прилагаемой инструкции. Условия амплификации генов представлены в таблице 2. Начальная температура денатурации составляет 96°С в течение 3 мин, последующие циклы по 20 с; общее количество циклов реакции составляет 30. Концентрация каждого праймера в реакционной смеси составляет 0,2 нМ (наномоль).

Продукты амплификации анализируют в 1% агарозном геле, фрагменты генов идентифицируют по размеру. Каждый фрагмент гена нарабатывают в количестве 1-2 мкг. Ампликоны очищают стандартной процедурой фенол-хлороформной экстракции, переосаждают этанолом, растворяют в 100 мкл бидистиллированной воды и используют для гидролиза рестриктазами. Гидролиз ампликонов проводят из расчета 2-3 кратного избытка фермента в течение 16-20 часов, при температуре 37°С, в случае использования эндонуклеазы рестрикции XhoI — при 50°С. По окончании реакции ампликоны снова очищают фенол-хлороформной экстракцией, переосаждают и растворяют в 10-20 мкл бидистиллированной воды, 1/5 часть используют для электрофоретического анализа. Основную часть препаратов ДНК хранят при -20°С до лигирования, но не более месяца.

Ампликоны соответствующих генов боррелий клонируют в составе вектора pETm. На первом этапе клонируют первый из пары генов в составе вектора pETm, а именно гены _rmospC _Bg, _rmflaA, _rmdbpB, _rm ospA и _rmbmpA. Для этого вектор гидролизуют эндонуклеазами рестрикции, сайты которых имеются на 3'- и 5'-концах клонируемого гена, отделяют от продуктов гидролиза в агарозном геле и выделяют вектор из геля с помощью специального набора (процедуры аналогичны описанным в примере 1). Очищенные гены и очищенный вектор лигируют в эквимолярном соотношении 5:1 с помощью Т4 ДНК лигазы фирмы «Сибэнзим» (Россия) согласно инструкции производителя фермента. Лигазной смесью методом электропорации трансформируют клетки E.coli штамма BL21 (DE3). Трансформацию клеток E.coli лигазной смесью проводят в соответствии с руководством фирмы-производителя электропоратора — «PeqLab, Biotechnologie GmbH» (Германия). Трансформированные клетки рассевают на агаризованную среду LB, содержащую канамицин 30 мкг/мл, и выращивают в течение ночи при 37°С. Полученные клоны клеток анализируют на наличие встроенного гена боррелий с помощью ПЦР с использованием внешних праймеров PR268 и PR269 аналогично описанному методу в Примере 1. Продукты ПЦР анализируют в 2% агарозном геле, нужные клоны идентифицируют по размеру ампликонов. Из нескольких положительных клонов выделяют плазмиды стандартным щелочным методом и секвенируют для подтверждения нуклеотидной последовательности клонированного гена боррелий. В случае удовлетворительного результата приступают ко второму этапу сборки рекомбинантной ДНК, кодирующей полипептиды. В результате выполнения первого этапа получают плазмиды pETm- _rmospC_Bg, pETm-_rmflaA, pETm- _rmdbpB, pETm-_rmospA и pETm-_rmbmpA, содержащие соответствующие гены боррелий.

На втором этапе в состав полученных рекомбинантных плазмид встраивают второй из пары генов, а именно гены _rmospC_Ba , _frflaB, _rmospA, ДНК-фрагмент, кодирующий C-концевой фрагмент белка р83 западносибирского изолята Borrelia garinii (_frp83). Для этого плазмиды pETm-_rm ospC_Bg, pETm-_rmflaA, pETm-_rm dbpB, pETm-_rmospA, pETm-_rmBmpA гидролизуют эндонуклеазами рестрикции, сайты которых имеются на 3'- и 5'-концах соответствующего клонируемого гена, очищают от продуктов гидролиза в агарозном геле и выделяют из геля с помощью набора (процедуры описаны в Примере 1). Очищенный ген (второй) и очищенную соответствующую плазмиду лигируют в эквимолярном соотношении 5:1, лигазной смесью трансформируют клетки E.coli и рассевают на агаризованную среду аналогично вышеописанной процедуре (первый этап). Полученные клоны клеток анализируют на наличие встроенного гена боррелий с помощью ПЦР с использованием внешних праймеров PR268 и PR269 аналогично описанному методу в Примере 1. Продукты ПЦР анализируют в 2% агарозном геле, нужные клоны идентифицируют по размеру ампликонов. Из нескольких положительных клонов выделяют плазмиды стандартным щелочным методом и секвенируют для подтверждения нуклеотидной последовательности клонированного гена боррелий.

Плазмиды с подтвержденным содержанием встроенных в них пар генов названы соответственно pET-_rm bmpA-_frp83, pETm-_rmospA-_frp83, pET-_rmdbpB-_rmospA, pET-_rmflaA- _frflaB и pET-_rmospC_Bg—_rm oSpC_Ba.

Пример 3. Экспрессия в клетках E.coli рекомбинантных химерных ДНК, кодирующих рекомбинантные химерные полипептиды, несущие эпитопы различных иммунодоминантных белков спирохет комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato.

Экспрессию вышеназванных химерных генов, клонированных в составе вектора рЕТ, осуществляют в клетках E.coli штаммов BL21 (DE3) и Rosetta 2. В настоящем изобретении в качестве основного продуцента использован штамм BL21 (DE3).

Музейную культуру рекомбинантного клона либо колонию клеток с чашки подращивают в течение ночи в 5 мл среды LB при 37°С. Затем ночную культуру переносят в 500 мл свежей среды LB, содержащей канамицин 30 мкг/мл, и выращивают при 37°С до плотности клеток 0,8-1,0 о. е. длине волны 600 нм, затем добавляют изопропил- -D-1-тиогалактопироназид (ИПТГ) до конечной концентрации 0,5 мМ. Культуру клеток инкубируют при 30°С и интенсивной аэрацией в течение 4 часов. По окончании клетки осаждают центрифугированием 10 мин при 3500 об/мин и хранят при -20°С до выделения рекомбинантных полипептидов.

Пример 4. Выделение и очистка рекомбинантных химерных полипептидов.

Выделение и очистку рекомбинантных химерных полипептидов из полученной биомассы (Пример 3) осуществляют с помощью одностадийной аффинной хроматографии лизата клеток на колонке с Ni-NTA-сефарозой CL-6B как в нативных, так и в денатурирующих условиях согласно протоколу фирмы-производителя "Quiagen" (США).

Для выделения рекомбинантных химерных полипептидов используют денатурирующие условия с применением гуанидина и мочевины. Клетки лизируют в 6М растворе гуанидинхлорида. Затем дебрис осаждают центрифугированием при 16000 g в течение 30 мин. Лизат инкубируют со смолой в течение часа при комнатной температуре, после чего суспензию загружают в колонку. Колонку промывают буфером, содержащим 8 М мочевину. Элюцию рекомбинантных химерных полипептидов осуществляют буфером, содержащим ступенчатый градиент имидазола: 20, 40, 60, 80, 250 и 500 мМ. Рекомбинантные химерные полипептиды, содержащие С-концевой 8-ми гистидиновый фрагмент, остаются связанными с сорбентом, в то время как бактериальные белки свободно проходят через колонку. Основной пул целевого рекомбинантного химерного полипептида смывают с колонки раствором 250 мМ имидазола. В процессе хроматографии собирают фракции, затем анализируют их электрофорезом в пластинах SDS-ПААГ по Леммли. Гели окрашивают раствором кумаси R250. Пример электрофоретического анализа фракций, полученных в процессе хроматографической очистки химерного белка _rmBmpA-_frp83, представлен на фиг.2.

Наиболее чистые фракции объединяют, замеряют концентрацию белка по Лоури и хранят при -20°С до использования в ИФА. Выход белков из одного литра культуры клеток Е.coli штамма BL21 (DE3) в среднем составляет 40-50 мг/л. Чистота рекомбинантных химерных белков достигает не менее 95%.

Пример 5. Использование очищенных рекомбинантных химерных полипептидов для иммуноферметного анализа.

Исследование иммунохимических свойств рекомбинантных химерных полипептидов проводят с помощью стандартного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Твердой фазой во всех вариантах ИФА служат 96-луночные плоскодонные планшеты из полистирола. Для исследования используют образцы сывороток крови различных групп доноров:

— группа больных с достоверным диагнозом ИКБ (сыворотка взята в период 2-8 недель с начала заболевания);

— группа здоровых доноров (сыворотки тестировались на наличие антител классов IgG и IgM к спирохетам комплекса B.burgdorferi s.1. и Treponema pallidum с помощью доступных коммерческих диагностических наборов).

Сыворотки были получены из 1-й городской инфекционной больницы г.Новосибирска и областного центра «СПИД» (г.Новосибирск).

Для приготовления рабочего раствора антигена и его последующей сорбции на планшетах используют 0,02 М карбонатно-бикарбонатный буферный раствор с рН-9,6. Для промывки планшетов, разведения сывороток и приготовления рабочего раствора конъюгата используют фосфатно-солевой буфер, содержащий 0,15М хлористого натрия и 0,1% твин-20 (ФСБ). Субстратный раствор включает 0,05М цитратный буфер (рН-5,0), перекись водорода (0,035%) и ортофенилендиамин (0,05%). Для выявления специфического комплекса антиген-антитело используют пероксидазные конъюгаты на основе моноклональных антител (МА) к IgG и IgM человека. Конъюгаты на основе МА были получены из лаборатории гибридомных технологий ЦНИИ рентгенорадиологии МЗ РФ.

Антиген разводят в карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9.6) до рабочей концентрации, вносят в лунки планшета по 100 мкл и оставляют для сорбции при +4°С на 15-18 часов. Рабочую концентрацию определяют при помощи тестирования сывороток здоровых доноров и сывороток пациентов с достоверным диагнозом клещевого боррелиоза на разных стадиях заболевания. После завершения сорбции планшеты с иммобилизованным антигеном промывают дважды карбонатно-бикарбонатным буферным раствором с 0.05% Твином-20, при этом в каждую лунку планшета вносят объем раствора не менее 250 мкл. По окончании промывки остатки жидкости удаляют, во все лунки планшета вносят по 100 мкл блокирующего раствора для сывороток, а затем по 10 мкл исследуемых сывороток, в разведении 1:10, планшет закрывают крышкой и инкубируют 30 мин при температуре 37°С. В качестве раствора для разведения сывороток используют глициновый буфер (ГСБ) с добавлением 2,0 мкг/мл лизата клеток E.coli BL21 (DE3) для устранения неспецифического связывания.

После окончания инкубации планшеты промывают моющим раствором (не менее 6 раз) и после удаления влаги в каждую лунку вносят 100 мкл конъюгата в рабочем разведении. Планшет инкубируют 30 мин при 37°С и затем промывают моющим раствором не менее 6 раз. Остатки влаги удаляют из планшета и в каждую лунку вносят по 100 мкл субстрата для пероксидазы. Субстрат готовят непосредственно перед использованием. Таблетку о-фенилендиамина растворяют в цитратно-фосфатном буфере до конечной концентрации 0,5 мкг/мл. После добавления субстрата планшет помещают в защищенное от света место и выдерживают 20 мин при комнатной температуре. Реакцию останавливают внесением в каждую лунку по 50 мкл 2 М раствора серной кислоты.

Результаты ИФА регистрируют на ридере Multiscan (Финляндия). Оптическую плотность (ОП) измеряют при длине волны 450 нм. Результат учитывают только в том случае, если среднее значение ОП в лунках с контролем конъюгата (ОП _Кк) не превышает 0.2, в лунках с К (-) среднее значение ОП (ОП_К.) не более 0.2, а в лунках с К (+) среднее значение ОП (ОП_к+) не менее 0.7. Результаты ИФА определяют по формуле:

ОП крит=ср.знач. ОП К (-) +0,2;

где 0,2 — коэффициент, установленный методом статистической обработки результатов.

Пробы, значения ОП которых ниже значения критической ОП, относят к серонегативным. Пробы, значения ОП которых равны или превышают значение критической ОП, оценивают как серопозитивные. Результаты исследования реактивности рекомбинатных химерных полипептидов с сыворотками представлены в табл.3.

Все сыворотки из группы здоровых доноров (n=10) показали отрицательный результат.

Данные ИФА, представленные в табл.3, убедительно доказывают специфичность взаимодействия рекомбинантных химерных полипептидов с IgG и IgM антителами больных иксодовым клещевым боррелиозом. Каждый заявленный рекомбинантный химерный полипептид может быть пригоден для диагностики иксодового клещевого боррелиоза, в том числе и для дифференцированного выявления ранней стадии и стадии диссеминированной инфекции.

1. Stanek G, Reiter M. The expanding Lyme Borrelia complex — clinical significance of genomic species? // Clin Microbiol Infect. 2011. 17. (4). 487-493. doi: 10.1111/j.1469-0691.2011.03492.x.

2. Postic D., Korenberg E., Gorelova N., Kovalevski Y.V., Bellenger E., Baranton G. Borrelia burgdorferi sensu lato in Russia and neighbouring countries: high incedence of mixed isolates // Res. Microbiol. 1997. 148. 691-702.

3. Коренберг Э.И., Нефедова В.В., Фадеева И.А., Горелова Н.Б. Основные итоги генотипирования боррелий в России // Бюл. сибирской медицины. 2006. Приложение 1. 87-92.

4. Масузава Т., Наумов Р.Л., Кудекен M., Харитоненков И.Г. Обнаружение Borrelia burgdorferi sensu stricto в Московской области, Россия // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2001. (2). 52.

5. Gorelova N.B., Korenberg E.I., Postik D., lunicheva Iu.V., Riabova Т.Е. The first isolation of Borrelia burgdorferi sensu stricto in Russia // Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol.2001.4. 10-12.

6. Рудакова С.А., Коломеец А.Н., Самойленко И.Е., Кузьминов A.M., Рудаков Н.В. Экспресс-диагностика трансмиссивных патогенов как основа дифференцированного подхода к профилактике инфекций, передающихся иксодовыми клещами // Бюл. СО РАМН. 2007. № 4. С.116-119.

7. Beklemishev А.В., А.К.Dobrotvorsky, A.V.Piterina, I.D.Ivanov, N.Yu.Nomokonova, N.N.Livanova. Detection and typing of Borrelia burgdorferi sensu lato genospecies in Ixodes persulcatus ticks in West Siberia, Russia. // FEMS Microbiol Lett. 2003 V.227, N.2, — P.157-161.

8. Рябченко А.В., Беклемишев А.Б. Мониторинг зараженности клещей рекреационной зоны г.Новосибирска возбудителями Лайм-боррелиоза. Вестник НГУ, 2007, Т.5, вып.1, С.106-110.

9. Мамаев А.Л., Рябченко А.В. и Беклемишев А.Б. Геновидовой состав спирохет Borrelia burgdorferi sensu lato, циркулировавших в иксодовых клещах, отловленных весной 2008 г. в рекреационной зоне г.Новосибирска. // Бюллетень СО РАМН. 2010, Т.30, № 2. С.13-16.

10. Wang, G., van Dam A.P., Schwartz // J.Clin. Microbiol. Rev. — Molecular typing of Borrelia burgdorferi sensu lato: taxonomic, epidemiological, and clinical implications. — 1999. — Vol.12. — P.633-653.

11. Parola, P., and D.Raoult. Tick-borne bacterial diseases emerging in Europe // Clin. Microbiol. Infect. — 2001. — V.7. — P.80-83.

12. Bruckbauer H.R., Preac-Mursic V., Fuchs R., Wilske B. Cross-reactive proteins of Borrelia burgdorferi // Eur J Clin Microbiol Infect Dis. — 1992. — V.11. — N.3 — P.224-232.

13. Carreiro MM, Laux DC, Nelson DR. Characterization of the heat shock response and identification of heat shock protein antigens of Borrelia burgdorferi // Infect Immun. — 1990. — V.58. — N.7. — P.2186-2191.

14. Magnarelli LA, Miller JN, Anderson JF, Riviere GR. Cross-reactivity of nonspecific treponemal antibody in serologic tests for Lyme disease // J Clin Microbiol. — 1990. — V.28. — N.6. — P.1276-1279.

15. Wilske В, Fingerle V, Schulte-Spechtel U. Microbiological and serological diagnosis of Lyme borreliosis // FEMS Immunol Med Microbiol. — 2007. — V.49. — N.1. — P.13-21.

16. Ge Y., li С., Corum L., et al. Structure and expression of the FlaА periplasmic flagellar protein of Borrelia burgdorferi. // Journal of Bacteriology. — 1998. — V.180. — P.2418-2425.

17. Gilmore R.D. Jr., Murphree R.L., James A.M., Sullivan S.A., Johnson B.J. The Borrelia burgdorferi 37-kilodalton immunoblot band (P37) used in serodiagnosis of early lyme disease is the flaA gene product // J. Clin. Microbiol. — 1999. — V.37. — P.548-552).

18. Berland R., Fikrig E., Rahn D., Hardin J. and FlaVell R.. Molecular characterization of the humoral response to the 41-kilodalton flagellar antigen of Borrelia burgdorferi, the Lyme disease agent. // Infection and Immunity. — 1991. — V.59. -. P.3531-35).

19. Steere A.C., Klitz W., Drouin E.E., Falk B.A., Kwok W.W., Nepom G.T., Baxter-Lowe L.A. Antibiotic-refractory Lyme arthritis is associated with HLA-DR molecules that bind a Borrelia burgdorferi peptide // J. Exp. Med. — 2006. — V.203. — P.961-971.

20. Aberer E. Lyme borreliosis — an update // JDDG. — 2007. — № 5. — P.406-413.

21. Heikkila Т., Seppala I., Saxen H., Panelius J., Yrjanainen H., Lahdenne P. Species-specific serodiagnosis of Lyme arthritis and neuroborreliosis due to Borrelia burgdorferi sensu stricto, B.afzelii, and B.garinii by using decorin binding protein A // J. Clin. Microbiol. — 2002. — V.40. — P.453-460.

22. Heikkila Т., Seppala I., Saxen H., Panelius J., Peltomaa M., Huppertz H.I., Lahdenne P. Cloning of the gene encoding the decorin-binding protein В (DbpB) in Borrelia burgdorferi sensu lato and characterisation of the antibody responses to DbpB in Lyme borreliosis // J. Med. Microbiol. — 2002. — V.51. — P.641-648.

23. Roessler D., Hauser U. and Wilske В. Heterogeneity of BmpA (P39) among European isolates of Borrelia burgdorferi sensu lato and influence of interspecies variability on serodiagnosis. // Journal of Clinical Microbiology. — 1997. — V.35. — P.2752-2758).

24. EP 1865062 «Altered OspA of Borrelia burgdorferi)), A16K 39/02, C07K 14/20, опубл. 12.12.2007 г.

25. US 5747294 «Compositions and methods for the prevention and diagnosis of Lyme disease», C07K 14/20, A61K 39/00, опубл. 05.05.1998 г.

26. US 5686267 «Nucleic acid molecule encoding antigen associated with lyme disease», C07K 14/20, опубл. 11.11.1997 г.

27. WO 0078966 «Groups of Borrelia burgdorferi and Borrelia afzelii that cause Lyme disease in humans», A61K 39/02, опубл. 28.12.2000 г.

28. RU № 2260047 «Рекомбинантная плазмидная ДНК, обеспечивающая синтез иммунодоминантного белка Borrelia garinii NT29, используемого для диагностики Лайм-боррелиоза (варианты)», C12N 15/09 опубл. 10.09.2005 БИ № 25.

29. US № 20040142399 « Recombinant FlaA as a diagnostic reagent», C07K 14/20, опубл. 22.07.2004 г.

30. US № 6248562 «Chimeric proteins comprising borrelia polypeptides and uses therefor», C07K 14/20, опубл. 19.06.2001 г.

31. Манзенюк И.Н., Манзенюк 0.10. Клещевые боррелиозы (болезнь Лайма). Кольцове. 2005 г.// http://entomologs.ru/laima_prodrobno_7.php

32. Marangoni A., Sparacino M., Cavrini F., Stomi E., Mondardini V., Sambri V. and Cevenini R. Comparative evaluation of three different ELISA methods for the diagnosis of early culture-confirmed Lyme disease in Italy.// J Med Microbiol. — 2005. — V.54. — N.4. — P.361-367.

33. Лайм-боррелиоз (Borrelios) // http://laboratory.rusmedserv.com/diaginfect/sintez/laimborrelioz/

34. Компания NovaTec представляет новые наборы для диагностики боррелиоза // Сайт «Медико-диагностическая лаборатория», рубрика «Инновации в медицине». http://www.meddialab.ru/text/v_poslednee_.htm?PHPSESSID=7ff9945d79e7e1bf13410b48a611ca04

35. National Center for Biotechnology Information, USA. http://www.ncbi.nlm.nih.gov

36. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование // М., 1984. С.157-185.

37. Рябченко А.В., И.В. Ивлева, А.Б. Беклемишев. Комплексная оценка зараженности клещей Ixodes persulcatus, распространенных в рекреационной зоне Новосибирского научного центра, спирохетами Borrelia burgdorferi s.1. // Ж. инфекционной патологии, 2004, Т.11, № 3-5, — С.107-110.

Боррелии распространены по регионам мира неравномерно. В России основное эпидемиологическое значение имеют два вида — B. afzelii и B. garinii, которые обнаружены в обширной лесной зоне от Прибалтики до Южного Сахалина.

Клещевой боррелиоз: болезнь на всю жизнь?

Клещевой энцефалит — опасное вирусное заболевание, поражающее центральную нервную систему, — вряд ли нуждается в представлении, особенно в связи с недавним всплеском заболеваемости. А вот к проблеме другой, но уже бактериальной, инфекции, также переносимой клещами, внимание врачей и ученых России было привлечено сравнительно недавно

В России боррелиоз (или болезнь Лайма, как ее называют в США) был впервые серологически (т. е. на основе наличия специфических антител) выявлен сотрудниками научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи РАМН под руковод­ством Э. И. Коренберга в 1985 г. Но только в 1991 г. иксодовые клещевые боррелиозы (ИКБ) были включены в официальный государственный перечень заболеваний, регистрируемых на территории России.

Наиболее распространенным этот недуг признан в США: ежегодно там заболевает более 16 тыс. человек. Рост заболеваемости боррелиозом в настоящее время наблюдается и во многих странах Европы.

Возбудитель — спирохета

Уже из самого названия видно, что переносчиками этой болезни, также как и клещевого энцефалита, являются клещи. В США болезнь Лайма переносят клещи Ixodes scapularis (в 1982 г. американский исследователь В. Бургдорфер именно от этих клещей впервые изолировал самих инфекционных агентов — боррелий); в Европе эту функцию выполняют клещи Ixodes ricinus, а у нас — печально известные таежные клещи Ixodes persulcatus.

Возбудитель боррелиоза — спирохета комплекса под пышным латинским названием Borrelia burgdorferi sensu lato (s. l.) — состоит в близком родстве с трепонемой — возбудителем всем известного сифилиса — и лептоспирой — возбудителем лептоспироза, серьезного заболевания, которому подвержены многие виды животных, и человек в том числе. Все перечисленные спирохеты имеют сходный внешний вид и по форме напоминают извитую спираль.

К сегодняшнему дню на основании генетических и фенотипических различий выделено 12 видов боррелий, но опасными для человека до недавнего времени считалось только три вида: B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. afzelii и B. garinii. Однако в последнее время появились сообщения, что от больных ИКБ был выделен еще один вид — B. spielmanii, что говорит о возможной патогенности и этого вида.

Боррелии способны не только передвигаться под кожей, но и проникать в кровеносные сосуды, перемещаясь с током крови во внутренние органы. Не является для них преградой и гематоэнцефалический барьер, защищающий кровеносные сосуды мозга

Боррелии распространены по регионам мира неравномерно. В России основное эпидемиологическое значение имеют два вида — B. afzelii и B. garinii, которые обнаружены в обширной лесной зоне от Прибалтики до Южного Сахалина.

В Институте химической биологии и фундаментальной медицины изучение боррелий было начато в 2000 г. Исследования, проведенные совместно с Институтом систематики и экологии животных СО РАН, направленные на выявление видового разнообразия боррелий, циркулирующих в природных очагах ИКБ Новосибирской области, позволили установить ряд фактов. Помимо широко распространенных B. afzelii и B. garinii были обнаружены редко встречающиеся генетические варианты этих видов.

Согласно данным световой микроскопии, зараженность таежных клещей боррелиями на территории Новосибирской области составляет 12—25 %. При микроскопическом исследовании фиксированных и витальных препаратов боррелии были выявлены как у взрослых клещей, собранных с растений, так и у частично или полностью напитавшихся личинок и нимф.

Поскольку эти спирохеты были обнаружены на всех стадиях развития клещей — от личинок до взрослых особей (имаго), все они могут служить источниками заражения. Цикл переноса возбудителя начинается с процесса питания неинфекционного клеща на инфицированном животном. Клещи, зараженные боррелиями, при следующем кормлении способны передавать эти микроорганизмы здоровым животным, а также продолжать воспринимать дополнительную «порцию» спирохет от инфицированных млекопитающих. На ранних этапах развития клеща в данный процесс вовлечены мелкие млекопитающие; взрослые клещи начинают питаться на крупных млекопитающих, и кроме того могут «покушаться» на человека, заражая его.

Проникнув в тело млекопитающего вместе со слюною клеща, спирохеты начинают усиленно размножаться в кожных покровах на месте укуса. Они способны не только передвигаться под кожей, но и проникать в кровеносные сосуды, перемещаясь с током крови во внутренние органы. Не является для них преградой и гематоэнцефалический барьер: размножаясь в спинномозговой жидкости, боррелии становятся причиной тяжелых нейроинфекций.

Первая стадия — обратимая

Иксодовый клещевой боррелиоз — полисистемное заболевание, при котором возможны поражения кожи, опорно-двигательного аппарата, нервной и сердечно-сосудистой систем. Характер клинических проявлений заболевания зависит от его стадии. Условно выделяют три стадии боррелиозной инфекции, хотя четко различить их не всегда удается. Заболевание, как правило, развивается последовательно, переходя из одной стадии в другую.

Первая стадия длится от 3 до 30 дней. За этот отрезок времени на коже (в области укуса клеща) вследствие воспалительной реакции может появиться красное кольцо, которое так и называется: кольцевая мигрирующая эритема. Начинается она с небольшого пятна в месте присасывания клеща, которое постепенно мигрирует к периферии. В типичных случаях центр пятна светлеет, а периферические участки образуют яркий красный валик в виде кольца неправильной формы диаметром до 15 см.

Исследования кожных проб, взятых из разных участ­ков эритемы, свидетельствуют о том, что в центре эритемного кольца боррелии практически отсутствуют, но, как правило, они всегда обнаруживаются на периферии. По сравнению с другими воспалительными изменениями эритема может сохраняться на коже в течение достаточно длительного промежутка времени.

Примерно у четверти больных кожные проявления заболевания сопровождаются такими симптомами, как: озноб, сонливость, мышечная слабость, боли в суставах и увеличение лимфатических узлов. Это сигнализирует о том, что боррелии распространяются по организму. Однако у большинства больных с эритемой ранние стадии болезни не сопровождаются симптомами интоксикации. К тому же, существует и так называемая безэритемная форма, которая, как правило, начинается остро и осложнена высокой температурой, болью в суставах и головной болью.

Также нужно отметить, что отсутствие симптомов болезни в первое время после укуса клеща не исключает развития болезни в будущем. При проведении своевременного лечения на первой стадии заболевания возможно полное выздоровление.

Лечение поздней стадии боррелиоза, развивающейся через полгода — год после заражения, требует длительного курса антибактериальной терапии. И борьба с хронической болезнью не всегда бывает успешной

Вторая стадия боррелиоза разви­вается в среднем через 1—3 месяца после инфицирования. К этому време­ни боррелии с током крови и лимфы попадают в различные органы и ткани, такие как: мышцы, суставы, миокард, спинной и головной мозг, а также селезенка, печень, сетчатка глаза, — и поражают их. Вот почему данную стадию характеризует столь значительное разнообразие клинических проявлений заболевания: неврологиче­ских, сердечных, кожных и т. д.

Признаки поражения нервной системы проявляются в виде менингита, моно- и полиневритов, очень часто — неврита лицевого нерва и др. Многие из этих симптомов могут наблюдаться одновременно. Наиболее частым неврологическим проявлением можно назвать менингополирадикулоневрит (синдром Баннаварта), характеризующийся парезом лицевого нерва. Кроме того, на этой стадии у некоторых больных могут появиться вторичные эритемы.

Наконец, третья стадия боррелиоза развивается через полгода — год после проникновения инфекции в организм. Чаще всего встречаются поражения суставов (хронический артрит), кожи (атрофический акродерматит) и хронические поражения нервной системы (хронический нейроборрелиоз). Лечение поздней стадии боррелиоза требует длительного курса антибактериальной терапии, однако впоследствии у некоторых больных с артритами признаки хронической инфекции наблюдаются в течение месяцев и даже нескольких лет после курса лечения антибиотиками.

Иммунный ответ

В развитие боррелиозной инфекции, как правило, вовлечено несколько патогенных механизмов. Некоторые синдромы, такие как менингит и радикулит, вероятно, отражают результат прямой инфекции органа, а вот артрит и полиневрит могут быть связаны с непрямыми эффектами, вызванными вторичным аутоиммунным ответом.

Иммунный ответ организма на боррелиозную инфекцию проявляется по-разному. Для контроля над распространением инфекции организм использует как врожденный (неспецифическая резистентность), так и адаптивный специфический иммунный ответ, т. е. выработку специфических антител против инфекционного агента. В течение первых двух недель после начала болезни у большинства пациентов действительно обнаруживаются иммуноглобулины против определенных антигенов боррелий — инфекционных белков, запускающих в организме механизм иммунного ответа.

Еще в 90-х гг. прошлого века в США были проведены первые исследования, направленные на раз­работку антиборрелиозной вакцины. Но и на сегодняшний день эффективной вакцины, предохраняющей от этого опасного заболевания, не существует. Вероятно, трудности с получением безопасных вакцин имеют отношение к особенностям иммунного ответа, наблюдаемого при боррелиозной инфекции. Он может инициировать выработку антител против некоторых собственных белков организма, т. е. вызвать опасные аутоиммунные реакции.

Причиной подобного иммунного ответа является молекулярная мимикрия, сходство (например, между липопротеином боррелий OspA и белком адгезии hLFA-1α), который вырабатывается нашими Т-клетками в синовиальной оболочке, выстилающей внутренние поверхности суставов. Так, осложнения, возникающие после проведения вакцинации вакциной на основе липопротеина OspA, в большинстве случаев проявлялись в виде артритов и аутоиммунных ревматоидных артритов. Работа по созданию приемлемой, безвредной и в то же время эффективной вакцины продолжается до сих пор.

Как диагностировать ИКБ?

Диагностику ИКБ обычно проводят на основании так называемого эпидемиологического анамнеза (установления факта посещения леса, укуса клеща), а также клинических признаков заболевания, главным из которых является наличие мигрирующей эритемы.

Особую сложность для диагнос­тики представляют заболевания, протекающие в безэритемных формах, одновременно с другими инфекциями, переносимыми клещами, например клещевым энцефалитом или анаплазмозом. В клинической практике известны случаи, когда у больного одновременно были выявлены безэритемная форма боррелиоза и клещевого энцефалита, которые привели его к повторной госпитализации по причине осложнений.

Случаи безэритемных форм можно диагностировать только с помощью лабораторных тестов. Выделение боррелий из проб кожи, проб сыворотки крови, спинномозговой или синовиальной жидкостей на специальные среды методом культивирования требует наличия специальных условий, дорогостоящих реактивов, занимает много времени, а главное — малоэффективно.

Первые исследования, направленные на разработку антиборрелиозной вакцины, были проведены еще в 90-х гг. прошлого века.

Но и на сегодняшний день эффективной вакцины против этого опасного заболевания не существует

Микроскопические исследования используются обычно при проведении анализа зараженности боррелиями клещей, но практически не применяются при диагностике ИКБ, поскольку в тканях и жидкостях организма инфицированного человека боррелии не накапливаются в таких количествах, чтобы их можно было обнаружить под микроскопом.

Для выявления боррелий может использоваться полимеразная цепная реакция (ПЦР), проведение которой позволяет обнаружить ДНК возбудителя. При проведении таких исследований нами было показано, что число боррелий, содержащихся в одном клеще, варьирует от одной до шести тысяч. Однако в настоящее время метод на основе ПЦР, как и все остальные методы диагностики боррелиоза, использовать в качестве самостоятельного теста для диагностики заболевания не рекомендуется, поскольку в данном случае чувствительность этого метода недостаточна, что может привести к так называемым «ложноотрицательным» результатам.

Тем не менее, при проведении совместных работ с Муниципальной инфекционной больницей № 1 г. Новосибирска было показано, что на ранней стадии болезни, до начала лечения, в комплексной диагностике заболевания метод ПЦР вполне применим наряду с иммунологическими методами анализа.

Для своевременного выявления смешанной инфекции определение ДНК необходимо проводить в первые четыре недели после присасывания клещей. Однако отрицательный результат, который при этом может быть получен, не исключает наличия заболевания и через 3—6 недель требует проведения серологических тестов (на специфические антитела).

Выявление антител к белкам боррелий сегодня и является основным способом лабораторной диагностики. В США и в странах Европы для повышения надежно­сти серодиагностики боррелиоза было рекомендовано использовать двухступенчатую схему тестирования сывороток крови, однако в России двухступенчатый подход не применяется из-за отсутствия отечественных тест-систем. Кроме того, иммуноглобулины из сыворотки крови больных ИКБ могут по-разному реагировать с основными белками разных видов боррелий, поэтому критерии тестирования, разработанные для одной страны, могут быть непригодны для другой.

В России сейчас широко применяют серологические методы детекции: иммуноферментный анализ (ИФА) и реакцию непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ), диагностическая значимость которых сопоставима. Однако применение второго метода может быть ограничено тем, что существует вероятность перекрестных реакций с близкородственными боррелиям микроорганизмами, в частности с Treponema palladium, возбудителем сифилиса. В целом же эффективность выявления у больных антител даже с помощью применения комбинации современных серологических тестов зависит от стадии заболевания.

Так что же такое боррелиоз — обычная инфекция или болезнь на всю жизнь? В дейст­вительности этот недуг не так безобиден, как представляется на первый взгляд.Иногда инфицирование организма боррелиями вызывает тяжелые отдаленные последствия, заболевания, которые только при ближайшем рассмотрении удается связать с боррелиозом, ранее перенесенным пациентами.

Благоприятный исход этого серьезного бактериального заболевания, переносимого клещами, во многом зависит от проведения своевременной, адекватной диагностики и соответствующей терапии. И лечение ИКБ должно заключаться не в бездумном приеме антибиотиков, как это иногда случается. Это — дело профессионалов, которые способны выявить не только клиническую симптоматику, но также индивидуальные особенности течения болезни и наличие сопутствующих заболеваний.

В России природные очаги КПЛ широко распространены. Клещевой сыпной тиф Северной Азии (возбудитель Rickettsia sibirica) регистрируют в Западной и Восточной Сибири, Алтайском, Красноярском, Хабаровском и Приморском краях. В начале XXI века заболеваемость увеличилась, ежегодно выявляется до 3000 и более случаев; это наиболее распространенный в России риккетсиоз.

Заболевания, передающиеся клещами

Россия — один из самых больших в мире ареалов инфекционных заболеваний, передающихся клещами. Ежегодно к врачам различных специальностей по поводу укуса клеща обращается несколько сотен тысяч пациентов [1].

Россия — один из самых больших в мире ареалов инфекционных заболеваний, передающихся клещами. Ежегодно к врачам различных специальностей по поводу укуса клеща обращается несколько сотен тысяч пациентов [1].

Известно, что клещи служат переносчиками целого ряда болезней человека (табл.), возбудителями которых являются вирусы, бактерии и простейшие.

Кроме перечисленных в таблице заболеваний, клещами могут передаваться и некоторые другие, в том числе туляремия, коксиеллез (лихорадка Ку).

Всем вышеуказанным болезням присущи некоторые общие черты: природная очаговость, сезонность (обычно весенне-летняя), передача человеку возбудителя иксодовыми клещами во время кровососания, острое начало болезни, лихорадка, симптомы интоксикации, признаки поражения нервной системы, различные высыпания на коже.

При акте кровососания клещ впрыскивает в кожу человека обезболивающие, сосудорасширяющие и другие вещества, а вместе с ними и возбудителей, которые находятся в кишечнике и слюнных железах клещей. Присасывание клеща, как правило, не вызывает боли и проходит незаметно. Наиболее излюбленные места расположения клещей — шея, подмышечные впадины, грудная клетка и паховые складки. Напившийся крови клещ увеличивается в десятки раз, принимая форму плотного серого или светлого шарика.

Около 25% заболевших лиц не указывают на присасывание клещей: оно происходит или в течение короткого периода времени, или в области тела, трудной для обнаружения [2].

Клещевой энцефалит (КЭ) — самый распространенный и тяжелый эпидемический энцефалит на территории России и многих европейских государств. Среди заболеваний, вызываемых арбовирусами, КЭ занимает одно из лидирующих положений.

Природные очаги КЭ зарегистрированы во всех лесных и таежных зонах России. Особенно высока заболеваемость КЭ в Приуралье, на Урале и в Сибири. Эндемичны по КЭ Калининградская и Ленинградская области. В 2008 г. впервые за многие годы в нескольких районах Московской области отдельные клещи были инфицированы вирусом КЭ.

Заражение человека КЭ может произойти не только во время присасывания клещей, но также алиментарным путем при употреблении сырого козьего или коровьего молока.

Инкубационный период — от 5 до 25 дней, при алиментарном заражении укорачивается до 2–3 дней.

При КЭ число манифестных форм соотносится с числом субклинических (асимптомных) как 1:100–200 и более. Анализ геномных структур всех основных известных к настоящему времени штаммов вируса КЭ позволил выявить три основных генотипа вируса, один из которых соответствует дальневосточному, второй — западному, а третий включает штаммы, отнесенные к урало-сибирскому варианту. Некоторые исследователи считают, что существует определенная связь между клиническими проявлениями КЭ и геновидом возбудителя [3].

Со времени начала изучения КЭ на основании клинических и лабораторных исследований выделяют: лихорадочную (стертую), менингеальную и очаговую, или паралитическую, формы заболевания [4].

Основной удельный вес в структуре КЭ занимают лихорадочная и менингеальная формы. На их долю приходится от 80 до 90 и более процентов заболеваний. Это в целом довольно доброкачественные, в большинстве самокупирующиеся формы, не требующие специального лечения. В крайне редких случаях — сотых и тысячных долях процента — наблюдается их переход в хроническую, прогрессирующую форму. КЭ — это энцефаломиелит, т. е. сочетанное поражение не только головного, но и спинного мозга [4].

Любая форма КЭ начинается остро, с озноба, стремительного повышения температуры тела до высоких цифр, сильной головной боли, миалгии. Возможны светобоязнь, боли в глазных яблоках. Больные обычно вялы, сонливы, реже возбуждены. При их осмотре обращают на себя внимание гиперемия кожи лица, шеи, верхней части туловища и слизистой оболочки ротоглотки, склерит, конъюнктивит. Характерна общая гиперестезия.

Лихорадочная форма ограничивается вышеописанной симптоматикой; продолжительность лихорадочного периода колеблется от нескольких часов до 5–6 дней, возможна двухволновая лихорадка. После стойкой нормализации температуры тела состояние больных улучшается, но астенический синдром может сохраняться еще 2–3 недели.

При менингеальной форме кроме симптомокомплекса, присущего лихорадочной форме, присоединяется менингеальный синдром: рвота на высоте головной боли, выраженная общая гиперестезия, ригидность мышц затылка, боль при надавливании на глазные яблоки, симптомы Кернига, Брудзинского и др. Иногда транзиторно можно выявить и очаговую неврологическую симптоматику: асимметрию лица, анизокорию, нистагм и др. При люмбальной пункции цереброспинальная жидкость (ЦСЖ) вытекает под повышенным давлением, прозрачная, иногда опалесцирующая. Плеоцитоз составляет от нескольких десятков до нескольких сотен клеток, в первые дни может быть нейтрофильным, затем лимфоцитарный; содержание белка в ЦСЖ умеренно повышено, глюкозы — нормальное; эти данные свидетельствуют о развитии серозного менингита.

Лихорадка продолжается до двух недель, изменения в ЦСЖ сохраняются относительно долго: от нескольких недель до нескольких месяцев. В периоде реконвалесценции продолжительное время присутствует астеновегетативный синдром.

Очаговая (паралитическая) форма отличается от двух вышеописанных тяжестью течения и высокой летальностью. На фоне лихорадки, общеинфекционного и менингеального синдромов появляется общемозговая симптоматика в виде нарушения сознания, двигательного возбуждения, судорог (генерализованных тонико-клонических или фокальных).

Особенности, присущие только КЭ, — наличие тяжелого поражения нервной системы в виде верхнего полиомиелита: парезов и параличей верхнего плечевого пояса (шеи и проксимальных отделов верхних конечностей — синдром «вислой головы»), сочетание центральных и периферических парезов: атрофий мышц и высоких рефлексов.

Другой особенностью КЭ является развитие у части больных синдрома Кожевниковской эпилепсии — тяжелейшего состояния в виде постоянных мышечных сокращений в одной половине тела — миоклоний, периодически усугубляющихся генерализованными эпилептическими судорогами. Присущей только КЭ особенностью является и переход заболевания у части больных в хронический, прогрессирующий процесс, заканчивающийся летальным исходом [5].

Какие изменения в области изучения и контроля за клещевым энцефалитом произошли за последние годы? При сохранении основных клинических форм КЭ наблюдаются: расширение ареала заболеваемости КЭ в нашей стране и странах Европы; появление коинфекций вируса КЭ с другими возбудителями (бактериальные, паразитарные микст-заболевания и др.); более тяжелое течение заболевания с развитием атипичных форм (появление геморрагических форм в России и за рубежом, паралитических форм КЭ при алиментарном заражении, поражение других органов — печени, кровеносной системы и др.).

Частота КЭ в России с 1974 по 1999 гг. увеличилась в 7 раз, что связано с ухудшением акарицидной обработки неблагополучных зон, снижением уровня вакцинации, ухудшением экологической ситуации, изменением климата, большим контактом с лесом, с социальными факторами: ухудшением материального уровня населения и др.

По материалам отечественных эпидемиологов, в разных природных очагах в зависимости от конкретных экологических условий в популяциях таежного клеща может быть до 5–10% взрослых особей, одновременно зараженных боррелиями и вирусом КЭ. До 60% менингоэнцефалитов в Западной Сибири, связанных с укусами клещей, обусловлены сочетанной инфекцией вируса клещевого энцефалита и B. burgdorferi [6].

В настоящее время нет радикального лечения паралитических поражений при КЭ, что сближает эти формы заболевания с полиомиелитом.

Единственным реальным методом предупреждения развития тяжелых инвалидизирующих и летальных последствий при КЭ остается профилактика — введение вакцины против клещевого энцефалита. В последние годы в Европе прекращен выпуск противоклещевого иммуноглобулина (ранее он применялся там только в профилактических целях), что аргументируется опасностью антителозависимого усиления инфекционного процесса и отсутствием доказательных методов, свидетельствующих о его положительном эффекте [7]. В России иммуноглобулин применялся и применяется в профилактических и лечебных целях [8]. Для лечения иммуноглобулин против КЭ вводят внутримышечно, дозы и схемы введения зависят от клинической формы.

Другим заболеванием, передающимся клещами, является иксодовый клещевой боррелиоз — ИКБ (синонимы: Лайм-боррелиоз, клещевая эритема, системный клещевой боррелиоз) — широко распространенное инфекционное природно-очаговое, бактериальное заболевание с трансмиссивным путем передачи, нередко принимающее хроническое, рецидивирующее течение и поражающее ряд систем организма. В 1982 г. американский исследователь В. Бургдорфер (W. Burgdorfer) обнаружил в кишечнике клещей ранее не известный вид боррелий, получивший свое название по имени впервые открывшего его автора. Как самостоятельная нозологическая форма ИКБ известен с 1984 г., когда была обнаружена связь нового вида боррелий с вызываемым им заболеванием [2].

Заболевания ИКБ широко распространены в восточном и западном полушариях. Случаи заболевания отмечаются в США, Канаде, практически по всей Европе (кроме стран Бенилюкса и Иберийского полуострова), России, Монголии, Северном Китае, Японии и других странах. По расчетам отечественных эпидемиологов ежегодно в нашей стране число заболевших достигает 10–11 тыс. человек. Вероятно, эта цифра занижена, т. к. в Германии, стране с меньшим населением и более благоприятной, чем Россия, эпидемиологической обстановкой, ежегодное число заболевших составляет около 60 тыс. человек, в США — более 13 тыс. человек [9].

Возбудитель ИКБ, B. burgdorferi, относится к семейству спирохет, выделяется из клещей-переносчиков, а у больных ИКБ из зоны эритемы, развивающейся на месте присасывания клеща, из крови, ЦСЖ, синовиальной жидкости при Лайм-артритах и др.

Основная масса заболеваний наблюдается в весенне-летний период (апрель-июнь), но сезон заболеваемости может значительно смещаться в зависимости от погодных условий — чем раньше наступает теплый период, тем быстрее пробуждаются и активизируются клещи, а значит, и чаще нападают на человека. На весенне-летний период приходится первый пик заболеваемости. Второй — на конец лета, начало осени (август-октябрь).

Попадая со слюной клеща в общий ток крови, боррелии разносятся по всему организму, оседая в различных органах (мозг, сердце, суставы, глаза, печень) и вызывая в них воспалительные изменения. Это острое поражение органов в результате диссеминации инфекции характеризует вторую стадию ИКБ.

Спустя месяцы или годы после окончания фазы диссеминации инфекции могут развиться новые симптомы, которые знаменуют собой третью стадию ИКБ — стадию хронического поражения органов или период персистирующей инфекции.

В соответствии с периодами инфекции и признаками их клинической манифестации выделяют три стадии болезни: первую — локальной инфекции, вторую — диссеминированной инфекции (острого поражения органов) и третью — персистирующей инфекции (хронического поражения органов). Для отнесения заболевания к третьей стадии ИКБ длительность воспалительных изменений со стороны пораженного органа должна быть не менее 6 месяцев [9]. Описанная выше последовательность поражения органов является скорее исключением, чем правилом, и редко можно видеть у пациента с ИКБ описанное выше хронологическое следование одной стадии за другой. Чаще встречаются проявления одной или двух стадий заболевания у одного больного. Так, у пациента с симптомами второй стадии ИКБ может не быть проявлений локальной инфекции или третья стадия ИКБ может манифестировать без острого поражения в первых двух фазах болезни.

Подобно другим спирохетозам ИКБ является системным заболеванием, развивающимся по этапам, соответствующим хронологии пораженных органов. Основными органами, вовлекающимися при заболевании, являются: кожа, нервная система, сердце и суставы. Стадии заболевания определяются по клиническим признакам преимущественного вовлечения пораженного органа, если известно время начала заболевания, или по длительности заболевания, если нет точного указания на начальный период болезни. ИКБ может протекать с последовательным чередованием всех стадий болезни, с «пропуском» одной из стадий или первичной манифестацией в любой стадии.

При локальной стадии инкубационный период болезни колеблется от 1 до 30 дней, составляя в среднем 7–10 суток. Начало болезни у подавляющего большинства постепенное. На месте присасывания клеща возникает пятно или папула. Это первичное покраснение в течение нескольких дней расширяется и увеличивается в размерах, формируясь в эритему со средним диаметром 10–15 см (колебания от 3–5 до 70 см). Эритема может быть в любой части тела, но чаще на туловище, бедрах или подмышечных областях.

Эритема является одним из характерных патогномоничных признаков ИКБ и является «золотым стандартом» диагностики заболевания. За присущее ей свойство увеличиваться в размерах ее называют «мигрирующей клещевой эритемой». Эритема может быть единственным признаком острого периода, но чаще ей сопутствуют другие симптомы заболевания: региональная лимфаденопатия, недомогание, слабость, миалгии, артралгии, респираторные проявления, повышение температуры до 37–38 °C, редко выше; озноб, головная боль, тошнота и рвота. У части больных заболевание может заканчиваться на этом этапе и эритема может исчезать спонтанно. У другой части эритема сохраняется в течение недель и даже месяцев и на ее фоне появляются признаки поражения других органов.

Для второй стадии заболевания (диссеминированной инфекции) характерно острое органное поражение нервной системы (нейроборрелиоз); внутренних органов (сердца, суставов, печени) и органа зрения (офтальмоборрелиоз). Вторая стадия ИКБ развивается через 2–10 недель после острого периода. Неврологические проявления при ИКБ довольно разнообразны, но большинство исследователей указывает на три наиболее частых вида поражений нервной системы: радикулоневриты, невриты черепных (лицевых) нервов и менингит. В половине и более случаев наблюдается сочетание указанных синдромов поражения, проявляющихся в различных симптомокомплексах. Кардиальные нарушения наблюдаются с 4–5 недели появления эритемы. Они включают изменения 1–3 степени предсердно-желудочковой проводимости, нарушения внутрижелудочковой проводимости, фибрилляцию предсердий и другие. Длительность кардиальных нарушений непродолжительна и не превышает нескольких недель. Наблюдаются и серьезные отклонения в виде дилятационной кардиомиопатии и фатального панкардита.

В противоположность нередко самопроизвольно разрешающимся первым двум стадиям ИКБ его третья стадия (хронической патологии органов) характеризуется хроническим, воспалительным, деструктивным процессом, поражающим кожу, суставы и нервную систему. В случае клещевой эритемы в остром периоде болезни интервал между эритемой и началом неврологической симптоматики составляет обычно 4–12 месяцев.

Основными формами третьей стадии ИКБ принято считать: нейроборрелиоз (прогрессирующий энцефаломиелит; цереброваскулярный нейроборрелиоз; моно- или полиневрит), сочетающийся с хроническим атрофическим акродерматитом (ХАА); дерматоборрелиоз (ХАА, доброкачественный лимфаденоз кожи); моно- и полиартриты.

Решающую помощь в диагностике ИКБ, особенно тех его вариантов, которые протекают без клещевой эритемы, может оказать серологическое исследование на наличие антител к B. burgdorferi. Наиболее часто применяются реакции: непрямой метод флуоресцирующих антител (нМФА), иммуноферментный анализ (ИФА), иммуноблот. Ранние IgM-антитела к B. burgdorferi начинают появляться не ранее 2–3 недели заболевания, поэтому на стадии эритемы их практически не находят и проводить серологическое обследование в этот период нецелесообразно. IgM-антитела обычно быстро исчезают, но могут сохраняться длительно. Их сменяют IgG-антитела, которые появляются на 3–4 неделе ИКБ и сохраняются в течение месяцев или лет. К сожалению, серологические тесты при ИКБ не стандартизованы [9]. Наличие антител к боррелиям подтверждает инфицирование B. burgdorferi, но не является абсолютным критерием активной или неактивной фаз заболевания [10]. Рядом исследователей указывается на молекулярный полиморфизм геновидов возбудителя, проявляющийся в гетерогенности поверхностных белков B. burgdorferi, что влечет за собой трудности в серодиагностике ИКБ [11, 12].

Лечение ИКБ проводится антибиотиками широкого спектра действия. Они назначаются перорально в стадии эритемы и парентерально в/в при нейроборрелиозе и ХАА во второй и третьей стадиях ИКБ.

В первой стадии этиотропное лечение проводят доксициклином в суточной дозе 0,2 г; препаратами выбора являются амоксициллин (0,5 г 3 раза в сутки), азитромицин (0,5 г/сутки). Длительность лечения от 10 дней до месяца. Во второй и третьей стадиях основным препаратом является цефтриаксон (2 г/сутки), возможно применение цефотаксима, массивных доз пенициллина. Длительность лечения — 2 недели.

Клещевые пятнистые лихорадки

Группа клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ) включает ряд природно-очаговых, вызываемых риккетсиями трансмиссивных заболеваний, среди которых как давно известные (марсельская или средиземноморская лихорадка, пятнистая лихорадка Скалистых гор, клещевой сыпной тиф Северной Азии, везикулезный риккетсиоз и др.), так и недавно впервые описанные (японская и израильская пятнистые лихорадки, африканская лихорадка клещевого укуса), в том числе и на территории нашей страны — астраханская пятнистая лихорадка и дальневосточный клещевой риккетсиоз [13].

Список этот продолжает пополняться, открываются новые представители риккетсий, описываются прежде неизвестные заболевания.

В России природные очаги КПЛ широко распространены. Клещевой сыпной тиф Северной Азии (возбудитель Rickettsia sibirica) регистрируют в Западной и Восточной Сибири, Алтайском, Красноярском, Хабаровском и Приморском краях. В начале XXI века заболеваемость увеличилась, ежегодно выявляется до 3000 и более случаев; это наиболее распространенный в России риккетсиоз.

Марсельская лихорадка (возбудитель R. conorii) встречается в прибрежных районах Черного и Азовского морей; астраханская (возбудитель R. conorii субтип caspiensis) — в низовьях Волги, Астраханской обл., Калмыкии и Западном Казахстане.

Всем КПЛ присущи некоторые общие клинические признаки, среди которых: наличие первичного аффекта на месте присасывания клеща в виде папулы или безболезненного небольшого инфильтрата с некрозом в центре, покрытого темной (черной) корочкой/струпом; регионарный лимфаденит; острое начало заболевания после инкубационного периода, средняя продолжительность которого составляет 1–2 недели; циклическое течение (начальный период — до появления сыпи; затем периоды разгара и реконвалесценции); ознобы, лихорадка от 3 до 10 дней; интоксикация (как правило, умеренная); головная боль, слабость, миалгия, артралгия, бессонница; гиперемия кожи лица и шеи, склерит, конъюнктивит; увеличение печени; появление экзантемы на 3–4 день после повышения температуры тела. Сыпь обычно обильная, пятнисто-папулезная, на коже туловища и конечностей, в том числе нередко на ладонях и подошвах, незудящая. Через 5–7 дней сыпь исчезает, на ее месте остается пигментация кожи.

КПЛ протекают, как правило, доброкачественно. Исключение составляет пятнистая лихорадка Скалистых гор, встречающаяся в Северной и Южной Америке.

Диагноз КПЛ базируется на данных эпидемиологического анамнеза (пребывание в природном очаге в сезон активности клещей) и характерном клиническом симптомокомплексе: первичный аффект на месте присасывания клеща, полиморфная экзантема, лихорадка.

Подтверждением диагноза служит выявление антител к антигенам соответствующих риккетсий в различных лабораторных методах: реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ), ИФА, реакции связывания комплемента (РСК), реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

Лечение КПЛ проводится препаратами тетрациклинового ряда (доксициклин по 0,2 г/сутки), фторхинолонами (ципрофлоксацин по 0,5 г 2 раза в сутки) или макролидами (эритромицин по 0,5 г 4 раза в сутки).

Профилактика специфическая, с использованием вакцины, разработана только для пятнистой лихорадки Скалистых гор, а неспецифическая — аналогична таковой для всех болезней, передающихся клещами.

Омская геморрагическая лихорадка (ОГЛ) — острое вирусное заболевание с природной очаговостью, характеризующееся лихорадкой, геморрагическим синдромом и поражением нервной системы. Возбудитель относится к группе арбовирусов, семейству Flaviviridae. Установлено, что основным резервуаром инфекции являются водяная крыса, рыжая полевка, ондатра, а также клещи Dermacentor pictus и D. marginatus. Случаев заражения от человека не наблюдалось. Природные очаги ОГЛ выявлены в районах Омской, Новосибирской, Тюменской, Курганской, Оренбургской областей.

Воротами инфекции является кожа в месте укуса клеща или ее мелкие повреждения, инфицированные при контакте с ондатрой или водяной крысой. На месте ворот инфекции первичного аффекта не наблюдается. Вирус проникает в кровь, гематогенно разносится по всему организму и поражает преимущественно сосуды, нервную систему и надпочечники.

Инкубационный период продолжается от 2 до 4 дней. Болезнь начинается внезапно, повышение температура тела достигает 39–40 °C. Появляются общая разбитость, интенсивная головная боль, боли в мышцах. Больные заторможены, неохотно отвечают на вопросы. Температура держится на высоком уровне 3–4 дня, затем литически снижается к 7–10 дню болезни. Лихорадка редко длится менее 7 и более 10 дней. Почти у половины больных наблюдаются повторные волны лихорадки (рецидивы), чаще на 2–3 неделе от начала болезни и продолжаются от 4 до 14 дней. Общая длительность болезни от 15 до 40 дней.

Уже с 1–2 дня у большинства больных появляется геморрагическая сыпь. Кожа лица, шеи и верхних участков груди гиперемирована, лицо одутловатое, сосуды склер инъецированы. Появляются носовые, легочные, кишечные, маточные кровотечения. Отмечается снижение артериального давления, глухость тонов сердца, брадикардия, дикротия пульса и отдельные экстрасистолы. У 30% больных развивается пневмония (мелкоочаговая), могут быть признаки поражения почек (протеинурия, микрогематурия, цилиндрурия). Со стороны центральной нервной системы отмечаются признаки менингита и менингоэнцефалита (при тяжелых формах болезни). В крови — выраженная лейкопения (1200–2000 в 1 мкл), СОЭ не повышена. Для подтверждения диагноза используют РСК, реакцию нейтрализации. Этиотропное лечение не разработано.

Крымская геморрагическая лихорадка (КГЛ) — острое вирусное заболевание, относящееся к зоонозам с природной очаговостью. Характеризуется двухволновой лихорадкой, общей интоксикацией, выраженным тромбогеморрагическим синдромом, тяжелым течением. Возбудитель открыт в 1945 г. М. П. Чумаковым.

Резервуаром вируса являются дикие мелкие млекопитающие (лесная мышь, малый суслик, заяц-русак, ушастый еж), а также домашние животные (овцы, козы, коровы). Переносчиком и хранителем являются клещи из рода Hyalomma. Заболеваемость характеризуется сезонностью с максимумом с мая по август (в нашей стране). Болезнь встречается в Крыму, Астраханской, Ростовской, Волгоградской областях, Краснодарском и Ставропольском краях, в Чечне, Калмыкии, а также в Средней Азии, Китае, Болгарии, Югославии, в странах Африки к югу от Сахары (Конго, Кения, Уганда, Нигерия и др.).

КГЛ относят к опасным инфекционным болезням. Заражение происходит не только при укусе инфицированным клещом или его раздавливании, но также при попадании на кожу или слизистые оболочки крови и кровянистых выделений больного.

Инкубационный период длится от 1 до 14 дней (чаще 2–7 дней). Болезнь начинается внезапно, температура тела быстро повышается до 39–40 °C, одновременно появляются головная боль, миалгия и др. симптомы интоксикации. Постоянным симптомом является лихорадка, которая длится в среднем 7–8 дней. Перед появлением геморрагического синдрома отмечается снижение температуры тела до субфебрильной, через 1–2 дня температура тела вновь повышается («двугорбая» температурная кривая). В период разгара заболевания (2–4 сутки от начала болезни) появляются геморрагическая сыпь на коже и слизистых оболочках, кровоизлияния в местах инъекций, носовые, желудочно-кишечные, маточные кровотечения, кровохарканье и т. д. Больные вялы, адинамичны, иногда, напротив, возбуждены. Нередок менингеальный синдром. Выраженность тромбогеморрагического синдрома определяет тяжесть и исход болезни. Период реконвалесценции исчисляется несколькими месяцами.

При постановке диагноза учитываются эпидемиологические данные (пребывание в эндемичных регионах, сезон и др.) и характерные клинические симптомы: острое начало, рано появляющийся и в разной степени выраженный тромбогеморрагический синдром, двухволновая температурная кривая, лейкопения, анемизация и др. [14]. Для специфической диагностики используют РНИФ, ИФА, ПЦР.

Больного КГЛ госпитализируют в бокс инфекционной больницы. В качестве этиотропного препарата рекомендуется рибавирин.

Эрлихиоз как эпидемическое инфекционное заболевание впервые был распознан в США в 1986 г. Выделяются две этиологически и эпидемиологически различные формы заболевания: моноцитарный эрлихиоз человека (МЭЧ), вызываемый E. chaffeensis, и гранулоцитарный эрлихиоз человека (ГЭЧ), или анаплазмоз, вызываемый E. phagocytophila. Возбудители заболеваний передаются человеку через укус инфицированных клещей, которые получают их при кормлении на инфицированных животных. Эрлихии принадлежат к семейству Rickettsiae, имеют характерную округлую форму с ограничивающей ее снаружи мембраной. Имеются публикации об обнаружении больных в Германии, Англии, Скандинавии, Франции. Эрлихиозы довольно широко распространены в США и Японии. Для России это новые заболевания, первые случаи моноцитарного эрлихиоза диагностированы в Пермской обл. в 1999 г., анаплазмоза — спустя несколько лет на Дальнем Востоке [1].

Продолжительность инкубационного периода при эрлихиозах составляет в среднем 8–14 дней.

Клинически МЭЧ и ГЭЧ почти не различимы и характеризуются комплексом симптомов: внезапным началом, ознобом, лихорадкой, головной болью, миалгией, тромбоцитопенией, лейкопенией, повышением активности печеночных ферментов. Сыпь наблюдается примерно у 1/3 больных с ЛЭЧ, но редко встречается у больных с ГЭЧ. Экзантема появляется на 1–8 день болезни, вначале на конечностях, затем на туловище, лице и шее, необильная, преимущественно пятнистая, иногда петехиальная. Продолжительность лихорадочного периода — от нескольких дней до 3 недель. Течение болезни варьирует от легкого доброкачественного до крайне тяжелого. В ряде случаев отмечаются такие осложнения, как респираторный дистресс-синдром, почечная недостаточность, неврологические нарушения, диссеминированное внутрисосудистое свертывание. Летальность при ЛЭЧ составляет 5%, при ГЭЧ — 10%, хотя, очевидно, истинная летальность может быть выше.

Для диагностики наиболее часто применяется РНИФ. Случаи заболевания подтверждаются 4-кратным нарастанием титров антител в РНИФ или однократным титром специфических антител в РНИФ ≥ 64, положительной ПЦР. При микроскопии мазков крови, окрашенных по Райту, в моноцитах или гранулоцитах можно обнаружить внутриклеточные включения соответствующих эрлихий.

Эрлихии чувствительны к препаратам тетрациклинового ряда, хлорамфениколу, что позволяет быстро и эффективно лечить это заболевание. Сообщаются случаи коинфекции Лайм-боррелиоза и эрлихиоза [15].

Бабезиоз, или пироплазмоз, — острое инфекционное заболевание, сопровождающееся лихорадкой, интоксикацией, анемией и тяжелым прогрессирующим течением. Бабезиоз является трансмиссивной паразитарной зоонозной инфекцией. У человека заболевание было впервые диагностировано в Югославии в 1957 году. Возбудитель относится к простейшим, классу споровиков, семейству Babesiidae. Бабезии располагаются внутри пораженных эритроцитов по центру или по периферии. При окраске по Граму имеют вид тонких колец диаметром 2–3 мкм или образований грушевидной формы диаметром 4–5 мкм. В мировой литературе к настоящему времени описано немногим более 100 случаев бабезиоза человека, большинство из которых закончилось летально. Формы заболевания с манифестацией инфекции наблюдались у лиц с выраженными нарушениями иммунной системы (после спленэктомии, с ВИЧ-инфекцией и др.). У людей с нормальной иммунной системой заболевание протекает бессимптомно, несмотря на наличие паразитемии, достигающей 1–2%.

Заболевание встречается в Европе (Скандинавия, Франция, Германия, Югославия, Польша, Россия) и в США (Восточное побережье). Хозяином являются мыши-полевки и другие мышевидные грызуны, собаки, кошки и крупный рогатый скот. Заболевают туристы, сельскохозяйственные рабочие, пастухи в период активности клещей (весенне-летний и летне-осенний сезоны). Возможна передача инфекции путем гемотрансфузий от инфицированных лиц, у которых имеется бессимптомная паразитемия [16]. После присасывания клеща возбудитель проникает в кровяное русло и в эритроциты. Репликация бабезий происходит в эритроцитах, которые лизируются не только под воздействием паразитов, но и под влиянием антиэритроцитарных антител. Когда число пораженных эритроцитов достигает 3–5%, наблюдаются клинические проявления заболевания. В период разрушения эритроцитов в кровь попадают продукты жизнедеятельности бабезий и гетерогенные протеины, что обусловливает мощную пирогенную реакцию и другие токсические проявления заболевания.

Инкубационный период продолжается от трех суток до трех недель (в среднем 1–2 недели). Болезнь начинается остро с озноба и повышения температуры тела до высоких цифр. Лихорадка сопровождается резкой слабостью, адинамией, головной болью, болями в эпигастрии, тошнотой и рвотой. Температурная кривая постоянного или неправильного типа. Высокая лихорадка продолжается обычно 8–10 суток с критическим падением до нормального уровня в терминальной стадии заболевания. С 3–4 дня болезни на фоне нарастания интоксикации наблюдаются бледность кожных покровов, увеличение печени, желтуха, олигоанурия. В последующем в клинической картине на первый план выступают симптомы острой почечной недостаточности. Летальный исход обусловлен уремией или присоединившимися интеркуррентными заболеваниями (пневмония, сепсис и т. п.). Клиническая диагностика трудна из-за редкости заболевания. Длительная лихорадка на фоне анемии, гепатомегалии, почечной патологии, отсутствие эффекта от приема антибиотиков заставляют проводить лабораторные исследования на бабезиоз. Важен учет эпидемиологических данных (укусы клещей, пребывание в эндемичной местности), выявление нарушений иммунного статуса. Диагноз подтверждается обнаружением возбудителя в мазке и толстой капле крови, а также в РНИФ. Дифференциальная диагностика проводится с тропической малярией, сепсисом, заболеваниями крови, ВИЧ-инфекцией. Основой лечения является ранняя антипаразитарная терапия. Эффективно применение хинина (650 мг/сутки) и клиндамицина (2,4 г/сутки) в течение 2–3 недель. Без этиотропного лечения заболевание часто (50–80% случаев) заканчивается летальным исходом [17].

Клещевые лихорадки Кемерово, Липовник — «новые» зоонозные природно-очаговые арбовирусные инфекционные болезни с трансмиссивным механизмом передачи возбудителей.

Возбудитель — РНК-содержащие вирусы из семейства Reoviridae (Orbivirus) группы Кемерово.

Резервуар и источники возбудителя — грызуны, мелкие млекопитающие, птицы. Основным видом, поддерживающим существование вирусов в природе, являются клещи Dermacentor spp. Естественная восприимчивость людей высокая. После перенесенного заболевания остается иммунитет. Повторные заболевания редки. Лихорадка Кемерово выявлена в лесной и лесостепной части Кемеровской области России, лихорадка Липовник — в ряде европейских стран. Заболевают в основном мужчины в возрасте 20–50 лет. Наибольшему риску подвержены лица, профессионально связанные с лесом (лесники, лесозаготовители, егеря и др.). Заболевания выявляются преимущественно в теплое время года, в период активизации клещей. Продолжительность инкубационного периода 4–5 дней [18]. Клинически характеризуются двухволновой лихорадкой, интоксикацией, иногда сыпью, кровоизлияниями, признаками менингоэнцефалита, миокардита. Лабораторная диагностика и лечение — в стадии разработки.

Итак, на территории России в теплое время года реальна опасность заражения одной или одновременно несколькими инфекциями, передающимися иксодовыми клещами. Клиническая диагностика их сложна, лабораторная в ранние сроки не всегда информативна.

Следует внушать населению необходимость мер защиты при посещении лесов, парков и других мест обитания клещей (надевание одежды типа комбинезона, применение репеллентов, само- и взаимоосмотр). При обнаружении клеща следует его немедленно удалить и обратиться к врачу-терапевту или инфекционисту. Желательно провести исследование клеща на наличие в нем возможных возбудителей. При обнаружении в клеще вируса КЭ пострадавшему вводится противоэнцефалитный иммуноглобулин, боррелий — назначаются антибиотики (доксициклин или амоксициллин) на 7–10 дней.

1. Злобин В. И. Эпидемиологический мониторинг и профилактика иксодовых клещевых инфекций в условиях сочетанных природных и антропургических очагов // Эпидемиология и вакцинопрофилактика, 2008, № 2, с. 10–14.
2. Деконенко Е. П. Клинико-эпидемиологические особенности Лайм-боррелиоза // Врач, 2004, № 2, с. 24–28.
3. Злобин В. И., Демина Т. В., Беликов С. И. и др. Генетическое типирование штаммов вируса клещевого энцефалита на основе анализа уровней гомологии фрагмента гена белка оболочки // Вопросы вирусологии, 2001, № 1, с. 17–22.
4. Шаповал А. Н. Клещевой энцефаломиелит. Л., Медицина, 1980, с. 256.
5. Субботин А. В., Семенов В. А., Арефьева Е. Г. и др. Хронический клещевой энцефалит в неврологической практике // Медицина в Кузбассе. Спецвыпуск № 5, 2008, 149–151.
6. Коренберг Э. И. Изучение и профилактика микстинфекций, передающихся иксодовыми клещами. www.tick.ru\Special\mixt\korenberg_mixt.asp.
7. Брокер М., Колларич Г. Профилактика после укуса клеща в эндемичных по клещевому энцефалиту регионах; современные подходы в постэкспозиционной профилактике (обзор), актуальные проблемы клещевых нейроинфенкций. Кемерово 22–23 мая 2008 г. // Медицина в Кузбассе. Спецвыпуск № 5, 2008, с. 29–36.
8. Воробьева М. С. Иммуноглобулин из донорской крови человека для профилактики и лечения клещевого энцефалита // Биопрепараты, 2008, № 2, с. 7–8.
9. Oschmann P., Kraiczy P., Halperin J., Brade V. (Eds) Lyme Borreliosis and Tick-borne Encephalitis. UNI-MED Verlag A. G., Bremen, 1999: 16–141.
10. Chary-Valckenaere I., Jaubhac B., Monteil H. et al. Diagnosis of Lyme disease: current difficulties and prospects // Rev. Rhum Engl. Ed. 1992; 62: 271–280.
11. Hulinska D., Votypka J., Valesova M. Persistence of Borrelia garinii and Borrelia afzelii in patients with Lyme arthritis // Zent Bakteriol, 1999; 289: 301–318.
12. Wormser G. P., Liveris D., Nowakowski J. et al. Association of specific subtypes of Borrelia burgdorferi with hematogenous dissemination in early Lyme disease // J Infect. Dis. 1999; 180: 720–725.
13. Тарасевич И. В. Современные представления о риккетсиозах // Клин. микробиол. и антимикроб. химиотер, 2005, т. 7, № 2, 119–129.
14. Источник: http://www.infectology.spb.ru/nosology/infectious/viral/krim_kongo.aspx.
15. Krause P. J. et al. Disease-specific diagnosis of coinfecting tickborne zoonoses: babesio-sis, human granulocytic ehrlichiosis, and Lyme disease // Clin. Infect. Dis. 2002. 34: 1184–1191.
16. Васильева И. С. Новые болезни, передаваемые клещами рода Ixodes (Ixodidae). Бабезиозы человека. lib2005.rat-info.ru/files/babeozy.doc.
17. Krause P. J. et al. Concurrent Lyme disease and babesiosis: evidence for increased severity and duration of illness // JAMA. 1996.275: 1657–1660.
18. Семенов В. А. Природно-очаговые клещевые инфекции в Западной Сибири. Кемерово, 2008.

Е. П. Деконенко, доктор медицинских наук, профессор

Г. Н. Кареткина, кандидат медицинских наук, доцент

ГУ ПИПВЭ им. М. П. Чумакова РАМН, Москва

(Borrelia burgdorferi sensu lato (болезнь Лайма), ДНК (ПЦР), качественный, кровь)

Borrelia burgdorferi sensu lato (болезнь Лайма), ДНК (ПЦР), качественный, кровь

Специальной подготовки к исследованию не требуется.

Исследуемый материал: Взятие крови

Borrelia burgdorferi sensu lato – это название группы бактерий, которая включает в себя 10 генотипов, среди которых как минимум три – Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia afzelii и Borrelia garini – являются возбудителями клещевого боррелиоза, или болезни Лайма. Боррелии имеют спиралевидную форму, очень подвижны.

Болезнь Лайма – инфекционное заболевание, которое передаётся человеку через укус зараженного иксодового клеща и характеризуется длительным течением, и поражением опорно-двигательного аппарата, кожи, сердечно-сосудистой и нервной систем. Своё название этот недуг получил от города Лайм, где впервые была зафиксирована вспышка инфекционных артритов у детей. Боррелиоз распространен как в Европе, Америке и Азии, так и на территории России.

В природе естественным «резервуаром» боррелий являются, как правило, дикие животные — млекопитающие и птицы. Находящиеся в крови животного боррелии попадают в организм клеща, который становится переносчиком болезни. Без участия клеща передача заболевания невозможна. Вероятность заражения в эндемичных районах может достигать 40 %.

Инкубационный период длится 3-32 дня. Через несколько дней в месте укуса клеща появляется кольцевидная эритема – своеобразное покраснение кожи, увеличивающееся с течением времени, отличающееся постепенным просветлением центра и валиком по краям. В месте поражения ощущается жжение или зуд. Кольцевидная эритема – один из важных симптомов болезни Лайма, облегчающий диагностику, но следует помнить, что у 20-30 % пациентов болезнь начинается без кожных проявлений. Среди первых симптомов также можно отметить повышение температуры, общую слабость, головную боль, увеличение лимфатических узлов.

Диссеминированная фаза отмечает разгар болезни: боррелии из места первичного заражения разносятся по всему организму, поражая различные органы. Диссеминированная фаза болезни может длиться до нескольких месяцев и, при отсутствии должного лечения трансформируется в персистирующую, которая длится годами. Также возможен исход в резидуальную фазу боррелиоза, сопровождающуюся формированием необратимых изменений в структуре внутренних органов.

При клещевом боррелиозе чаще всего развивается поражение опорно-двигательной, нервной, сердечно-сосудистой систем; глаз, печени, почек, что проявляется радикулитами, невритами, энцефалитами, высыпаниями на коже, артритами, тендовагинитами, миозитами, миокардитами, конъюнктивитами.

Заражение во время беременности может сопровождаться инфицированием плаценты и самопроизвольным прерыванием беременности.

Лечение включает в себя антибактериальную, дезинтоксикационную и противовоспалительную терапию.

Вакцины против болезни Лайма на данный момент не разработано.

Метод ПЦР – полимеразная цепная реакция, позволяющая идентифицировать наличие в биологическом материале искомый участок генетического материала.

Подробнее о методе ПЦР — его разновидностях, преимуществах и области применения в медицинской диагностике.

Референсные значения — норма

(Borrelia burgdorferi sensu lato (болезнь Лайма), ДНК (ПЦР), качественный, кровь)

Информация, касающаяся референсных значений показателей, а также сам состав входящих в анализ показателей может несколько отличаться в зависимости от лаборатории!

• Уточнение диагноза боррелиоза после укуса клеща при наличии симптомов раннего клещевого боррелиоза (головной боли, общей слабости, характерных поражений кожи в месте укуса клеща в виде кольцевидной эритемы) .
• Оценка эффективности лечения клещевого боррелиоза.
• Дифференциальная диагностика диссеминированной и персистирующей форм клещевого боррелиоза и поражений другого происхождения при наличии соответствующей симптоматики.
• Своевременное лечение и предотвращение осложнений после укуса клещом беременной женщины.

Повышение значений (положительный результат)

• ДНК Borrelia burgdorferi sensu lato обнаружена в крови: диагноз «клещевой боррелиоз» подтвержден;
• В редких случаях возможен ложноположительный результат.

Понижение значений (отрицательный результат)

• ДНК Borrelia burgdorferi sensu lato не обнаружена: диагноз «клещевой боррелиоз» исключен;
• В редких случаях возможен ложноотрицательнй результат.

У больных отмечаются сердцебиение, понижение арте­риального давления, головокружения, приступы тошноты. При своевременном лечении симптомы болезни быстро проходят. Отсутствие характерных признаков данного заболевания затрудняет его распознавание без проведения лабораторного анализа. В лаборатории отделения особо опасных инфекций проводится исследование крови на анаплазмоз (метод – ИФА), стоимость 1 анализа – 400 руб. 00 коп.

Инфекции, передающиеся при укусах клещей

Иксодовые клещи — переносчики многих микроорганизмов. До недавнего времени в России было известно несколько инфекций, передающихся иксодовыми клещами, такие как клещевой энцефалит и иксодовые клещевые боррелиозы. В 1998 г. у клещей обнаружены моноцитарные эрлихии, а у пациентов был впервые верифи­цирован моноцитарный эрлихиоз человека, а в 2002 г. выявлен возбудитель еще одного заболевания, переда­ющегося клещами — анаплазмоза.

Наличие единого механизма передачи инфекций, общих хозяев и переносчиков возбудителей определяют существование сочетанных очагов природно-очаговых инфекций: клещевого энцефалита (КЭ), иксодовых клещевых боррелиозов (ИКБ), моноцитарного эрлихиоза человека (МЭЧ) и гранулоцитарного анаплазмоза человека (ГАЧ).

Биология возбудителей инфекций человека, связанных с клещами, сегодня находится в процессе активного изучения. Каждый из возбудителей после проникновения в организм человека занимает свою «экологическую нишу»: вирус КЭ, поступающий с жидкой слюной клеща в кровоток, поражает нервную систему, начальный период размножения боррелий происходит в кожном покрове, эрлихии и анаплазмы являются паразитами клеток крови — лейкоцитов. Кроме того, могут развиваться сложные патологические процессы, обусловленные одновременным попаданием в организм различных микробов.

Инфекции, передающиеся клещами, имеют довольно много сходных клинических черт, особенно в начале заболевания.

Любое заболевание, возникающее после укуса клеща, может быть моно — или смешанной инфекцией, вызванной одним, двумя или даже тремя микроорганизмами. С апреля по октябрь при обращении к врачу людей, пострадавших от укусов клещей или после посещения леса, необходимо обследовать на весь комплекс заболеваний, возбудители которых передаются клещами.

БОЛЕЗНЬ ЛАЙМА ИЛИ ИКСОДОВЫЙ КЛЕЩЕВОЙ БОРРЕЛИОЗ

– это природно-очаговое заболевание, переносчиком которого являются клещи.

Наибольшая часть территорий с природными очагами боррелиоза находится в России, на этих же территориях распространен клещевой энцефалит.

Число выявляемых случаев заболевания боррелиозом растет по мере совершенствования лабораторной диагностики и улучшения информированности врачей и населения. Установлено, что число зарегистрированных больных в 5-10 раз меньше реальной заболеваемости. Неполное выявление больных приводит к увеличению числа больных с хроническим течением заболевания. Калужская область является территорией, где имеются благоприятные условия для размножения искодовых клещей и передачи заболевания человеку (умеренный климат с лесными ландшафтами, обилие лесных животных). В Калужской области ежегодно выявляются больные боррелиозом во всех районах области и в г. Калуге.

В 2009 году в Калужской области было зарегистрировано 148 случаев заболеваний боррелиозом. В 2010 г. – 84 случая, из них 54 случая зарегистрировано в Калуге, 12 – в Обнинске, 18 случаев в районах области (Боровском, Дзержинском, Жуковском, Кировском, Козельском, Людиновском, Спас-Деменском, Тарусском, Юхновском). В 2011г – 87 случаев , из них 34 – в г. Калуге , 11 – в г. Обнинске , 23 – в Людиновском районе , 19 – в остальных районах области ( Боровский , Жиздринский , Жуковский , Кировский , Козельский , Малоярославецкий , Спас-Деменский ).

Зараженность клещей боррелиями в Калужской области высокая, при обследовании клещей, снятых с людей боррелии обнаружены в 2009 г. – в 14,9%, в 2010 г. – в 12,2% случаев, в 2011 г. – 14 % случаев. Болезнь развивается у 40-50% людей, укушенных инфицированными клещами (в течение первого месяца). Передача возбудителей обычно происходит в течение первых часов присасывания клеща к телу человека. Чаще всего заражение происходит в период с апреля по июль, в меньшей степени в августе-сентябре. Выражена сезонность заболевания – с мая по ноябрь с подъемом заболеваемости в июне-июле.

Боррелиоз – заболевание с длительным хроническим течением, при котором поражаются многие органы и системы: кожа, нервная и сердечно-сосудистая системы, суставы, глаза, печень, селезенка и другие. Инкубационный период от 2 до 35 дней, в среднем – 2 недели.

В раннем периоде болезни (через 1-3 недели после укуса клеща), если произошло заражение, в месте укуса возникает покраснение кожи (пятно = эритема), которое постепенно расширяется до десятков сантиметров (от 5 -10 см и более) и обычно сохраняется долго (до 4-10 недель). У некоторых людей покраснение кожи не появляется вообще, и в этих случаях это серьезное заболевание трудно распознать. Врачи лечат таких больных от других заболеваний со схожими симптомами. Также для раннего этапа заболевания характерно повышение температуры до 38-39 о С, головная боль, боли в различных мышцах, суставах. Эти симптомы продолжаются 3-7 дней. В этот период возбудитель через кровь разносится в различные органы, где развивается воспаление. Чаще всего это сердце, суставы, глаза, уши, селезенка и лимфатические узлы. И поэтому больные обращаются к различным специалистам: невропатологам, ревматологам, дерматологам, и их ошибочно лечат как больных с дерматитом, радикулитом, менингитом, артритом.

В более поздний период болезни поражаются различные внутренние органы и системы: кожа, суставы, нервная системы, глаза.

В связи с тем, что многие симптомы, характерные для клещевого боррелиоза, встречаются и при других заболеваниях, своевременное выявление этого заболевания возможно при обязательном лабораторном обследовании. При обнаружении лабораторией в клещах возбудителей боррелиоза необходимо обратиться к участковому врачу (терапевту, инфекционисту или педиатру) для назначения курса профилактического лечения. Раннее начало лечения позволяет сократить длительность течения болезни и предупредить развитие поздних стадий заболевания. На поздней стадии болезни лечение не всегда успешно, в частности, при поражении нервной системы.

Лабораторные исследования для выявления больных боррелиозом проводятся в лаборатории отделения особо опасных инфекций. Сыворотки крови для исследования на боррелиоз принимают как от лечебных учреждений, так и от граждан. Исследование крови на боррелиоз позволяет определить, произошло ли заражение после укуса клеща, а также освободился ли организм от возбудителя после проведенного лечения. В этих случаях забор крови производится через 20 дней от начала заболевания, или через 30-40 дней после укуса клеща (забор крови осуществляется по месту жительства в поликлинике).

МОНОЦИТАРНЫЙ ЭРЛИХИОЗ ЧЕЛОВЕКА.

Моноритарный эрлихиоз человека (МЭЧ) — природно-очаговая инфекция, протекающая в виде острого лихорадочного заболевания, которую вызывают внутриклеточные микроорганизмы, пора­жающие один из видов белых кровяных телец — моноциты.

Заражение этим заболеванием происходит при укусах клещей. Случаи заболевания наблюдаются весной и летом, что связано с работой на дачных участках, частыми посещениями леса и парковых зон отдыха.

Заражение происходит при присасывании клеща. Возбудитель проникает в кровь, размножение происходит внутри клеток внутренней оболочки сосудов и белых кровяных телец. Проникнув в чувствительные клетки, микроорганизмы размножаются в них, и после разрушения клеток выходят в кровь и инфицируют новые.

Поражаются различные органы: кожа, печень, нервная система, костный мозг. Не исключается возможность хронического течения заболевания.

Инкубационный период продолжается от 1 до 29 дней (в среднем 13 дней). Заболевание начинается остро, с повышения температуры до 38- 40ºС, сопро­вождается ознобом, появляются такие симптомы как слабость, недомогание, головная боль. У большинства больных наблюдаются першение в горле, заложенность носа, сухой кашель.

Также могут наблюдаются головные боли, головокружение, тошнота, рвота, нарушения чувствительности, мышечные и суставные боли, иногда боли в области позвоночника, сердцебиение, изменения артериального давления.

У трети пациентов наблюдается двухволновое течение заболевания. Вторая волна имеет большую степень тяжести. Отсутствие характерных для данного заболевания симптомов (преобладают общие симптомы, характерные для многих заболеваний) существенно затрудняет распознавание инфекции без проведения анализа крови. В лаборатории отделения особо опасных инфекций проводится исследование крови на эрлихиоз (метод – ИФА), стоимость 1 анализа – 400 руб. 00 коп.

ГРАНУЛОЦИТАРНЫЙ АНАПЛАЗМОЗ ЧЕЛОВЕКА

Гранулоцитарный анаплазмоз человека (ГАЧ) — острое лихорадочное заболевание с разнообразной клини­ческой картиной, возбудитель которого передается клещами.

Человек заражается во время кровососания клеща, весной и летом при посещении леса, а также во время работы на садовых и дачных участках.

Возбудитель попадает в кровь человека со слюной клеща и разносится по всему организму, вызывая воспаление во внутренних органах. В результате проникновения возбудителя в белые кровяные тельца (лейкоциты) и размножения в них, снижается иммунитет к другим инфекциям.

Инкубационный период от 3 до 23 дней (в среднем 13 дней). Характерно острое начало заболевания с подъемом температуры до высоких цифр. Лихорадка длится от 2 до 10 дней. Появляются слабость, недомогание, головная боль.

У больных отмечаются сердцебиение, понижение арте­риального давления, головокружения, приступы тошноты. При своевременном лечении симптомы болезни быстро проходят. Отсутствие характерных признаков данного заболевания затрудняет его распознавание без проведения лабораторного анализа. В лаборатории отделения особо опасных инфекций проводится исследование крови на анаплазмоз (метод – ИФА), стоимость 1 анализа – 400 руб. 00 коп.

Клещевой энцефалит—острая вирусная болезнь, характеризующаяся поражением серого вещества головного и спинного мозга, приводящая к развитию вялых парезов и параличей.

Возбудитель — вирус из семейства тогавирусов. Различают центрально-европейский и дальневосточный варианты вируса клещевого энцефалита.

Относится к природно-очаговым заболеваниям с весенне-летней сезонностью. Заражение человека происходит при укусе клеща, возможен пищевой путь передачи (при употреблении сырого молока коз, реже — коров). Заболевание встречается в местах обитания клещей, в таежной и лесостепной местности. В слюнных железах зараженного клеща вирус находится в огромном количестве. При укусе клеща, вирус попадает в кровь и далее проникает в клетки центральной нервной системы, вызывая в них тяжелые изменения.

Симптомы и течение заболевания.

От передачи вируса до появления первых признаков заболевания проходит от 8 до 23 дней (чаще 10— 14), иногда до 60 дней. Заболевание, как правило, начинается остро. Изредка наблюдаются такие явления, как слабость, недомогание, головная боль, тошнота, нарушения сна. Характерны скоропроходящая слабость в конечностях, мышцах шеи, онемение кожи лица и шеи. Позднее развивается воспаление мозговых оболочек и вещества головного мозга. Температура тела достигает 39—40° С и держится от 2 до 10 дней. Наиболее типичны вялые параличи и парезы шейно-плечевой мускулатуры (симптом «свисания головы»), поражение черепных нервов, а также резкая головная боль, ригидность мышц затылка (невозможно прижать подбородок к груди). Нарушается сознание (от легкой оглушенности до комы).

Диагноз . При распознавании учитывают эпидемиологические предпосылки (укус клеща, сезонность) и характерные поражения центральной нервной системы. Лабораторным подтверждением диагноза служит появление на 5-7 день болезни Ig М и нарастание титра антител Ig G , выявляемое с помощью ИФА.

Лечение . Строгий постельный режим в остром периоде болезни.

Лицам, не привитым или привитым менее чем за 10 дней до укуса клеща в качестве специфического лечения в течение первых 96 часов необходимо введение противоэнцефалитного донорского иммуноглобулина. После 4 дня в течение 28 суток -инкубация клещевого энцефалита — препарат не вводят, т.к. это может утяжелить проявления болезни.

Прогноз . Период выздоровления длится до 2 лет. Развившиеся параличи мышц восстанавливаются частично. Смертность 5—30%.

Профилактика .Лицам, планирующим выезды в эндемические районы (Урал, Сибирь, Дальний Восток, Северно-Западный регионы России и др.) проводятся коллективная и индивидуальная профилактика и вакцинация вакциной против клещевого энцефалита. Завершение курса целесообразно за 1 месяц до выезда в очаг. Другими словами, если Вы собираетесь во время летних каникул поехать со студенческим строительным отрядом в таежные леса или отдохнуть в палатке на берегу реки где-нибудь в Карелии, Вам уже в феврале — марте необходимо начать вакцинацию.

Если Вы не смогли уберечь себя от присасывания клеща, не снимайте его самостоятельно, а обратитесь в ближайшее лечебное учреждение, где медицинские работники обязаны оказать Вам помощь по удалению клеща и проинформировать Вас о необходимости обращения за медицинской помощью в случае возникновения отклонений в состоянии здоровья в течение З недель после укуса.

Снятого клеща ни в коем случае нельзя выбрасывать.

Его необходимо поместить в чистый флакон с небольшим кусочком смоченной водой ваты, марли или фильтровальной бумаги и принести на анализ в вирусологическую лабораторию, где проверят снятого с Вас клеща на наличие в его организме вируса клещевого энцефалита и дадут соответствующие рекомендации.

Вирусологическая лаборатория ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Калужской области» расположена по адресу: г. Калуга, ул. Чичерина, д. 1 а.

Телефон для справок (4842) 55-01-09.

Часто задаваемые вопросы .

Возможна передача возбудителей клещевых инфекций также контактным путем – через мелкие повреждения кожи (при раздавлении клеща, при расчесах), а также пищевым путем – при употреблении сырого молока овец и коз, реже коров. От человека к человеку указанные инфекции не передаются! Кошки и собаки к вирусу клещевого энцефалита невосприимчивы, собаки могут болеть боррелиозом!

Когда больше вероятность заражения клещевыми инфекциями?

Больше всего человек подвержен укусам клещей весной и в первой половине лета, когда активность клещей самая высокая. Начало сезона зависит от погодных условий. При ранней, теплой весне укусы клещей регистрируются уже в конце марта. Однако в отношении клещевого энцефалита нюанс заключается в том, что в весенний период количество вируса в клещах чаще невысокое вследствие того, что вирус клещевого энцефалита очень плохо переносит резкие смены температур, особенно ее переходы через 0 0 С. Поэтому во второй половине лета или в осенний период, несмотря на то, что вероятность укуса клеща ниже, вероятность развития тяжелой формы при этом более высокая за счет накопления большего количества вируса.

Клещи остаются активными в течение суток, но в солнечные дни их наибольшая агрессивность отмечается с 8 до 11 ч , заметно снижается в дневное время и снова возрастает в период с 17 до 20 ч . В пасмурные дни и во время теплого моросящего дождя их способность к нападению остается примерно на одном уровне. В очень жаркие дни и во время сильного дождя их активность резко падает.

Большинство природных мест обитания клещей находятся в лесных массивах, реже среди мелкого леса и вырубок, в хвойных лесах и лесостепных зонах. Клещи любят влажные места, поэтому их численность в таких местах наиболее велика. Много клещей обитает на дне лесных оврагов, а также по лесным опушкам, в зарослях ивняков по берегам лесных ручейков, а также вдоль лесных опушек и по заросшим травой лесным дорожкам. Клещи также обнаруживаются в лесах промышленного назначения, на берегах водохранилищ, заповедниках и даже в городских парках. Они способны чувствовать запах человека или животного на расстоянии около 10 м, и концентрируются в тех местах, где часто бывают животные и люди (места водопоев, лесные тропы).

Как защититься от укуса клеща?

Клещи не взбираются на растения на большую высоту (не более 1,5 м), они цепляются к одежде чаще в области ног и способны ползти только вверх . Поэтому при походе в лес или прогулках по местам с множеством кустарников и высокой травой необходимо приспособление носимой одежды таким образом, чтобы она максимально затрудняла прикрепление и проникновение клеща под одежду:

1. желательно, чтобы одежда была гладкой и светлой (на светлом фоне клещей легче заметить);

2. ворот и манжеты рубашки нужно плотно застегнуть, ее нижнюю часть заправить в брюки (для лучшего эффекта можно перевязать тесемками);

3. нижнюю часть брюк заправить в сапоги или носки;

4. использовать кофту или куртку с капюшоном с завязками или на резинке (для защиты шеи), при отсутствии капюшона – головной убор.

Рекомендуется применять акарицидные препараты – убивающие клещей («Гардекс аэрозоль экстрим» (Италия), «Гардекс антиклещ», «Фумитокс-антиклещ» и др.). Акарицидными препаратами обрабатывают только одежду (брюки – в области голеней, куртку или рубашку – нижнюю часть, область ворота, а также манжеты рукавов).

По вопросу обработки от клещей дачных участков можно обращаться в отдел профилактических работ по телефону: 57-24-80.

На поиск места прикрепления и прикрепление клеща может уходить до 1-2 часов, но необходимо отметить тот факт, что самцы клещей, в отличие от самок, питаются кровью более короткое время (несколько часов) и затем самостоятельно отпадают — таким образом, укус клеща-самца может остаться незамеченным . Поэтому во время пребывания в лесу необходимо проводить беглые само- и взаимоосмотры через каждые 15-30 минут .

При выходе из леса или ночевке в лесу нужно производить тщательный осмотр с раздеванием. При осмотре следует особо обращать внимание на волосистые части тела, кожные складки, ушные раковины, подмышечные и паховые области, грудь (наиболее частые места присасывания клещей), а в одежде – складки и швы. Тщательному осмотру подлежат все предметы, выносимые из леса, а также животные . При возможности для пикника или ночлега на природе выбирайте открытые места с минимально выраженным травяным покровом и кустарниками или практически полностью лишенные их.

• Вакцинация – самая надежная защита от клещевого энцефалита! При выезде в неблагополучные по клещевому энцефалиту регионы необходимо обратиться в лечебное учреждение либо в прививочный пункт для проведения экстренной вакцинации.

Лечение иксодового клещевого боррелиоза должно проводиться в инфекционной больнице, где, прежде всего, проводится терапия, направленная на уничтожение боррелий, — при этом наступает полное выздоровление. В противном случае болезнь прогрессирует, переходит в хроническое течение, а в ряде случаев приводит к инвалидности.

Анаплазмоз и эрлихиоз в настоящее время недостаточно изучены. Показано, что эти заболевания поддаются лечению антибиотиками .

— Если клещ не был проверен на зараженность клещевыми инфекциями, то необходимо незамедлительно обращаться в лечебное учреждение;

— Если в первые дни или недели после посещения леса у Вас повышается температура, Вы чувствуете недомогание и слабость, которые не связаны с простудой – обязательно обратитесь к врачу.

В лаборатории отделения особо опасных инфекций проводится комплексное исследование клещей на возбудителей инфекций, передающихся клещами: боррелиоз, энцефалит, анаплазмоз и эрлихиоз — стоимость 800 руб. Клещи, снятые с животных не исследуются (при обнаружении клеща на домашнем животном следует обратиться к ветеринару)! Возможно комплексное исследование крови на инфекции, передаваемые клещами – стоимость 800 руб. Также в лаборатории проводятся исследования крови на инфекции, передающиеся клещами: боррелиоз – стоимость 590 руб., эрлихиоз – стоимость 400 руб., анаплазмоз – стоимость 400 руб., энцефалит 1 – стоимость 450 руб.

— лаборатория особо опасных инфекций (ул. Чичерина 1а)

ежедневно с 8-00 до 15-42, обед с 12-30 до 13-00,

выдача результатов анализов с 14-30 до 15-30.

— отдел профилактических работ (ул. Баррикад, д. 181)

После лимфогенной или гематогенной диссеминации возбудителя поражается кожа (вторичная эритема), развиваются невриты черепно-мозговых нервов, менингит, энцефалит, кардиты, артриты, акро-дерматит. При заражении возбудителем нейроборрелиоза (В. garinii) эритема может отсутствовать.

В. burgdorferi

Прокормителями этих клещей, а следовательно, и резервуарами возбудителей ИКБ, служит широкий круг поражаемых ими хозяев (птицы, грызуны, олени, собаки, лошади, другие домашние и дикие животные). Очаги ИКБ выявлены к 2000 г. на 50 административных территориях России. В Санкт-Петербурге регистрируется 250 случаев ИКБ в год (5 случаев на 100 000 жителей). В Пермской области уровень заболеваемости в 4—5 раз превышает средние показатели по стране.

Генетическая особенность В. burgdorferi состоит в наличии у нее как линейной, так и кольцевой ДНК, что сообщил в 1999 г. У. Бургдорфер. По другим данным, обнаружена также линейная плазмида, кодирующая синтез белков наружной мембраны, с которыми связаны патогенные свойства возбудителя. Заражение ИКБ происходит через укусы клещей. Со слюной клеща боррелии проникают в кожу в месте укуса, где часто, но не всегда, развивается первичная эритема диаметром от 3—5 до 15—20 см, центр которой бледнее периферии.

После лимфогенной или гематогенной диссеминации возбудителя поражается кожа (вторичная эритема), развиваются невриты черепно-мозговых нервов, менингит, энцефалит, кардиты, артриты, акро-дерматит. При заражении возбудителем нейроборрелиоза (В. garinii) эритема может отсутствовать.

Для первичного обнаружения живых боррелий у клещей используют метод темнопольной микроскопии, который, с целью идентификации возбудителя, должен быть дополнен более точными методами диагностики, включая ЦПР. Из крови, ликвора или тканей больного боррелии выделяются с трудом. Для обнаружения IgM (ранние стадии заболевания) и IgG (спустя несколько месяцев) используют непрямую реакцию иммунофлуоресценции и ИФМ со специфическим антигеном.

Специфическая профилактика не разработана. Для лечения используют тет­рациклины и бета-лактамные антибиотики.

Требуется перевезти громоздкую медицинскую технику? Компания «Союз» (soyuzcargo.ru) поможет вам с доставкой сборных грузов до пункта назначения.

Не нашли подходящую информацию? Не беда! Воспользуйтесь поиском на сайте в верхнем правом углу.

Источники: http://eva.ru/kids/messages-3262682.htmhttp://helix.ru/kb/item/447http://www.freepatent.ru/patents/2514230http://scfh.ru/papers/kleshchevoy-borrelioz-bolezn-na-vsyu-zhizn/http://www.lvrach.ru/2009/05/9211031/http://www.analizmarket.ru/tests/id/3753http://40.rospotrebnadzor.ru/center/stats/85760http://www.rkm.kz/node/1733

---

Поделиться новостью в соцсетях

 

Об авторе: kosmetologclear

Похожие записи

• Перхоть У Ребенка 10 Лет Причины И Лечение
• Чем лечить лишай у ребенка на голове в домашних условиях
• Лечение Грибка На Ногтях Ног В Домашних Условиях

« Предыдущая запись

Anti borrelia burgdorferi igg что значит

Следующая запись »

Guidelines на русском лечение грибка ногтей